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首页 » 常识 » 问答 » 粪大肠菌群的测定多管发酵法HJT3
TUhjnbcbe - 2024/4/3 8:50:00

一、目的

掌握中华人民共和国环境保护行业标准HJ/T关于水质粪大肠菌群的多管发酵法,了解滤膜法。通过粪大肠菌群的测定,了解大肠菌群的生化特性。

二、原理

人的肠道中存在三大类细菌:①大肠杆菌(G-);②肠球菌(G+);③产气荚膜杆菌(G+)。由于大肠菌群的数量大,在体外存活时间与肠道致病菌相近,且检验方法比较简便,故被定为检验肠道致病菌的指示菌。

粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分,主要来自粪便。在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。用提高培养温度的方法,造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件,使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群,从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。粪大肠菌群的测定可以用多管发酵法和滤膜法。

多管发酵法以最可能数(mostprobablenumber,简称MPN)来表示试验结果。实际上它是根据统计学理论,估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑并且进行大量重复检定,可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加,这种差异便会减少,对于细菌含量的估计值,大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上,水样检验所要求重复的数目要根据所要求数据的准确度而定。

三、材料

本方法所用试剂除另有注明外,均为符合国家标准的分析纯化学试剂;实验用水为新制备的去离子水。

(1)锥形瓶(ml)1个、试管(18ml×ml)6或7支、大试管(容积ml)2支、移液管1ml的2支及10ml的1支、培养皿(直径90mm)10套、接种环、试管架1个。

(2)革兰氏染色液一套:草酸铵结晶紫、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液。

(3)显微镜。

(4)单倍乳糖蛋白胨培养液。

成分:蛋白胨10g

牛肉浸膏3g

乳糖5g

氯化钠5g

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml

蒸馏水ml

制法:将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于ml蒸馏水中,调节pH为7.2~7.4,再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml,充分混匀,分装于含有倒置的小玻璃管的试管中,于高压蒸汽灭菌器中,在℃下灭菌20分钟,储存于暗处备用。

(5)三倍乳糖蛋白胨培养液:按上述配方比例3倍(除蒸馏水外),配成3倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液,制法同上。

(6)EC培养液。

成分:胰胨20g

乳糖5g

胆盐三号1.5g

磷酸氢二钾(K2HPO4)4g

磷酸二氢钾(KH2PO4)1.5g

氯化钠5g

蒸馏水ml

制法:将上述成分加热溶解,然后分装于含有玻璃的试管中。置高压蒸汽灭菌器中,℃下灭菌20分钟。灭菌后pH值应为6.9。

四、步骤

1.水样的采集和保藏

采集水样的器具必须事前灭菌。

2.水样的处置

水样采集后,迅速送回实验室立即检验,若来不及检验应放在4℃冰箱中保存。若缺乏低温保存条件,应在报告中注明水样采集与检验相隔的时间,若较清洁的水可在12小时以内检验,污水要在6小时内结束检验。

3.水样接种量的确定

将水样充分混匀后,根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用3个不同的水样量接种。同一种接种水样量要有5管。

相对未受污染的水样接种量为10ml、1ml、0.1ml。受污染水样接种量根据污染程度接种1ml、0.1ml、0.01ml或0.1ml、0.01ml、0.ml等。使用的水样量可参考表9-1。

表9-1接种用水量参考表

如接种体积为10ml,则试管内应装有3倍浓度的乳糖蛋白胨培养液5ml;如接种量为1ml或少于1ml,则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10ml中。

五、测定方法与步骤

1.初发酵试验

将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37±0.5℃下培养24±2小时。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在内产气不明显,可轻拍试管,有小气泡升起为阳性。

2.复发酵试验

轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管,用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。在44.5±0.5℃温度下培养24±2小时(水浴箱的水面应高于试管中培养基液面)。接种后所有发酵管必须在30分钟内放进水浴中。培养后立即观察,发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性

3.结果的计算

根据不同接种量的发酵管所出现的阳性结果的数目,从表9-2或表9-3中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种水样为ml(2份)、10ml(10份),总量ml时,查表9-2可得每升水样中的粪大肠菌群;接种5份10ml水样、5份1ml水样、5份0.1ml水样时,查表9-3求得MPN指数,MPN值再乘10,即为1L水样中的粪大肠菌群。

表9-2粪大肠菌群检数表

注:接种水样ml(2份)、10ml(10份)、总量ml。

表9-3最可能数(MPN)表

注:接种5份10ml水样、5份1ml水样、5份0.1ml水样时,不同阳性及阴性情况下ml水样中细菌数的最可能数和95%可信限值。

如果接种的水样不是10ml、1ml和0.1ml,而是较低的或较高的3个浓度的水样量,也可查表9-3求MPN值,再经下式计算成每ml的MPN值。

思考题

1.测定水中大肠杆菌群数有什么实际意义?为什么选用粪大肠杆菌群作为水的卫生指标?

2.论述胆盐在EC培养液中的作用。

3.根据我国相关水质标准,讨论你这次的检验结果。

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