一、目的
掌握中华人民共和国环境保护行业标准HJ/T关于水质粪大肠菌群的多管发酵法，了解滤膜法。通过粪大肠菌群的测定，了解大肠菌群的生化特性。
二、原理
人的肠道中存在三大类细菌：①大肠杆菌（G－）；②肠球菌（G＋）；③产气荚膜杆菌（G＋）。由于大肠菌群的数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，且检验方法比较简便，故被定为检验肠道致病菌的指示菌。
粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，主要来自粪便。在44.5℃温度下能生长并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群。用提高培养温度的方法，造成不利于来自自然环境的大肠菌群生长的条件，使培养出来的菌主要为来自粪便中的大肠菌群，从而更准确地反映出水质受粪便污染的情况。粪大肠菌群的测定可以用多管发酵法和滤膜法。
多管发酵法以最可能数（mostprobablenumber，简称MPN）来表示试验结果。实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。如果从理论上考虑并且进行大量重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。不过只要每一稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度。因此在实验设计上，水样检验所要求重复的数目要根据所要求数据的准确度而定。
三、材料
本方法所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。
（1）锥形瓶（ml）1个、试管（18ml×ml）6或7支、大试管（容积ml）2支、移液管1ml的2支及10ml的1支、培养皿（直径90mm）10套、接种环、试管架1个。
（2）革兰氏染色液一套：草酸铵结晶紫、革氏碘液、95％乙醇、蕃红染液。
（3）显微镜。
（4）单倍乳糖蛋白胨培养液。
成分：蛋白胨10g
牛肉浸膏3g
乳糖5g
氯化钠5g
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1ml
蒸馏水ml
制法：将蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于ml蒸馏水中，调节pH为7.2～7.4，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，于高压蒸汽灭菌器中，在℃下灭菌20分钟，储存于暗处备用。
（5）三倍乳糖蛋白胨培养液：按上述配方比例3倍（除蒸馏水外），配成3倍浓缩的乳糖蛋白胨培养液，制法同上。
（6）EC培养液。
成分：胰胨20g
乳糖5g
胆盐三号1.5g
磷酸氢二钾（K2HPO4）4g
磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g
氯化钠5g
蒸馏水ml
制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃的试管中。置高压蒸汽灭菌器中，℃下灭菌20分钟。灭菌后pH值应为6.9。
四、步骤
1．水样的采集和保藏
采集水样的器具必须事前灭菌。
2．水样的处置
水样采集后，迅速送回实验室立即检验，若来不及检验应放在4℃冰箱中保存。若缺乏低温保存条件，应在报告中注明水样采集与检验相隔的时间，若较清洁的水可在12小时以内检验，污水要在6小时内结束检验。
3．水样接种量的确定
将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用3个不同的水样量接种。同一种接种水样量要有5管。
相对未受污染的水样接种量为10ml、1ml、0.1ml。受污染水样接种量根据污染程度接种1ml、0.1ml、0.01ml或0.1ml、0.01ml、0.ml等。使用的水样量可参考表9-1。
表9-1接种用水量参考表
如接种体积为10ml，则试管内应装有3倍浓度的乳糖蛋白胨培养液5ml；如接种量为1ml或少于1ml，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10ml中。
五、测定方法与步骤
1．初发酵试验
将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。在37±0.5℃下培养24±2小时。产酸和产气的发酵管表明试验阳性。如在内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起为阳性。
2．复发酵试验
轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm接种环或灭菌棒将培养物转接到EC培养液中。在44.5±0.5℃温度下培养24±2小时（水浴箱的水面应高于试管中培养基液面）。接种后所有发酵管必须在30分钟内放进水浴中。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性
3．结果的计算
根据不同接种量的发酵管所出现的阳性结果的数目，从表9-2或表9-3中查得每升水样中的粪大肠菌群。接种水样为ml（2份）、10ml（10份），总量ml时，查表9-2可得每升水样中的粪大肠菌群；接种5份10ml水样、5份1ml水样、5份0.1ml水样时，查表9-3求得MPN指数，MPN值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群。
表9-2粪大肠菌群检数表
注：接种水样ml（2份）、10ml（10份）、总量ml。
表9-3最可能数（MPN）表
注：接种5份10ml水样、5份1ml水样、5份0.1ml水样时，不同阳性及阴性情况下ml水样中细菌数的最可能数和95％可信限值。
如果接种的水样不是10ml、1ml和0.1ml，而是较低的或较高的3个浓度的水样量，也可查表9-3求MPN值，再经下式计算成每ml的MPN值。
思考题
1．测定水中大肠杆菌群数有什么实际意义？为什么选用粪大肠杆菌群作为水的卫生指标？
2．论述胆盐在EC培养液中的作用。
3．根据我国相关水质标准，讨论你这次的检验结果。
