mRNA技术作为一种极具潜力的通用技术，广泛应用于疫苗开发、肿瘤免疫治疗、CAR-T、基因编辑等领域，而mRNA疫苗更是在本次新冠疫情中大放异彩。mRNA疫苗是在提取目的抗原基因序列后体外转录合成mRNA，再将其导入人体内被细胞摄取后，立即进行翻译并表达成蛋白质，最终刺激机体引发免疫性应答，从而产生免疫保护的核酸制剂。
针对不同的靶标，mRNA药物的生产工艺路线表现得成熟统一，这一点和抗体药物区别开来（不同的抗体需要摸索不同的纯化工艺路线）。一旦整个mRNA药物生产线搭建运转起来，扩大生产便极容易实现。
一、RNA合成方法
目前mRNA疫苗或药物的生产工艺环节，大体可分为质粒DNA原液制备、mRNA原液制备、mRNA制剂制备三个阶段。耀海生物在前两个环节都有承接项目能力，关于质粒DNA制备的发酵环节已进行过介绍，详见服务mRNA技术的质粒发酵工艺应用。
1.固相化学合成法（SolidPhaseChemicalSynthesis）
体外RNA合成可以分为固相化学合成和酶法合成。
固相化学合成是将树脂等固体作为反应的基质，其上连接正在合成的RNA分子，再通过不断地过滤与补充原料进行反应，就可以依次将不同的单体分子连接到上面，按照目的序列合成出所需的RNA。但这种方法仅适用于一些短链RNA合成（50-nt），因为随着RNA的长度增加，合成产量和纯度会下降。
mRNA固相合成方法
2.酶法合成（EnzymaticSynthesis）
相对于化学合成，酶法合成具有效率高、条件温和的特性，能够合成较长序列的mRNA，是一种高效低耗的RNA合成方案。
mRNA药物生产首先是生产含有目的基因片段的质粒原液，然后用限制性内切酶处理收集后的质粒，将其酶切成线性双链DNA模板。再利用RNA聚合酶处理线性化后的质粒片段，通过体外转录（IVT）使其合成mRNA,随后在DNaseI酶降解DNA模板及纯化后，通过在5’端加上帽子结构和3’端加ployA尾以加强mRNA的稳定性，在这个过程中会运用各种酶进行转录，即酶法合成RNA。
mRNA酶法合成
二、转录的基本原理
以DNA双链中的反义链为模板，在RNA聚合酶催化下，以四种核苷三磷酸NTPS为原料，根据碱基配对原则(A-U、T-A、G-C)，各核苷酸间通过形成磷酸二酯键相连形成mRNA，不需要引物的参与，合成的RNA带有与DNA编码链相同的序列。
1.模板识别
模板识别阶段主要指RNA聚合酶识别启动子序列并与启动子DNA双链特异性结合的过程。
2.转录起始
不需要引物。RNA聚合酶结合在启动子上以后，使启动子附近的DNA双链解旋并解链，形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板DNA的碱基配对。转录起始就是RNA链上第一个核苷酸键的产生。
3.转录延伸
一旦进入转录延伸阶段，底物NTP不断被添加到新生RNA链的3’-OH端，随着转录泡复合体与RNA聚合酶沿着DNA模板向前移动，DNA双螺旋持续解开，暴露出新的单链DNA模板，新生RNA链的3’端不断延伸，在解链区形成RNA-DNA杂合物。而在解链区的后面，DNA模板链与其原先配对的非模板链重新结合成为双螺旋，RNA链被逐步释放。
4.转录终止
当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来，这就是转录的终止。
转录基本原理
三、体外转录的基本原理
体外转录的基本原理
mRNA体外转录合成是在体外的无细胞体系中，以质粒DNA为模板，利用RNA聚合酶转录合成mRNA，并后续为其添加5’帽子和3’poly(A)尾巴等修饰，以模拟体内mRNA合成的过程。体外转录法可以获得长度10kb以上的invitro-transcribedmRNA（IVTmRNA），并在进入靶细胞后快速表达目的基因。
T7RNA聚合酶（T7RNApolymerase，T7RNAP）
具有高度启动子专一性，激活位于T7启动子下游的DNA的转录，其合成mRNA的速度比普通大肠杆菌的RNA聚合酶快5倍左右。T7RNA聚合酶在体外也具有启动子特异性的转录活性，是第一个被鉴定出来的单亚基RNA聚合酶，可在大肠杆菌中过表达，用于构建体外转录系统。
主要由32个ɑ螺旋和9个β折叠片构成。C端结构域有2/3跟Klenowfragment相似，由finger，thumb，palm，组成，N端结构域（1-）是T7RNA聚合酶特有的，涉及启动子识别和DNA解链。T7RNApolymerase可以解开-1to-4的碱基对，该区域的模板链置于含有催化活性位点的裂缝区域，形成一个transcriptionbubble。在promoterDNA双链邻近的大小沟，T7RNApolymerase来实现启动子双链区域的序列特异性识别。Intercalatingβhairpin（-）插入到DNA大沟里，实现碱基的直接识别。由-残基形成specificityloop同样可以识别碱基对。N端结构域通过插入一段弹性的loop结构(93-)来识别DNA小沟中富含AT碱基的DNA序列(-17——13)。
体外转录基本原理T7RNP和启动子序列之间的相互作用
T7RNP和启动子序列之间的相互作用
转录初始和延伸阶段，T7RNAP在构象上差异显著：在延伸阶段构象稳定，T7lysozyme可以抑制T7RNApolymerase从初始阶段向延伸阶段发展，但是对于转录延伸阶段的酶活性几乎没有影响。从转录初始进入到延伸阶段以后，T7RNAP的N端结构域发生重排，启动子结合结构域被破坏，创造出一个能够容纳7bpDNA-RNA异质性双链的通道，在异质性双链脱落以后，允许RNA转录本通过。
依赖启动子的聚合酶活性
T7RNAP同时有依赖于DNA模板和RNA模板的RNA聚合酶活性，可以高度特异性地识别保守启动子序列，但其聚合酶活性具有非常大的弹性尺度。不管双链DNA启动子序列后面跟着的是DNA序列，还是RNA序列，抑或是chemericDNA-RNA，T7RNAP都可以启动转录合成RNA序列，这可以看作是T7RNAP依赖于启动子的聚合酶活性。
拥有启动子双链DNA序列的各种不同模板
有启动子双链DNA序列的各种不同模板均可合成RNA
不依赖启动子的聚合酶活性
有研究利用RNA-Seq研究体外转录反应产物序列和产量分布情况，发现IVT反应中的RNA产物末端可以折回形成发卡结构，将自身变成引物，在3端添加NTPs，会产生超过预期长度产物的RNA，并且随着RNA产物浓度的升高，此过程会跟以DNA为模板的正常转录过程发生竞争。以上过程，可以看作是独立于启动子序列的聚合酶活性反应。而且此过程可能会循环发生，导致更长的RNA产物反而占据主导地位，成为IVT反应的主要产物。
IVT反应中超过预期长度的mRNA形成机制
四、mRNAUTR序列设计
mRNA的必要结构组成元件包括帽子结构（Cap）、编码抗原蛋白的开放阅读框（ORF）、5’UTR区、、3’UTR区和Poly（A）尾结构。相较于DNA分子，mRNA天然地更不稳定，这有利于蛋白翻译的调控，但在IVTmRNA的应用中如何保持mRNA稳定性和高翻译效率是个难题。UTR不仅在基因表达的转录后调控中发挥着重要作用——包括调节Mrna的核外转运、翻译效率、亚细胞定位和稳定性等，例如在编码硒蛋白的mRNA中，经由3’UTR中一个保守的茎环结构介导，可在UGA密码子中特异性掺入被修饰过的氨基酸——硒代半胱氨酸,因此在mRNA药物的开发中，需要对mRNA的非翻译区域（Untranslatedregion，UTR）精心设计以保证足够的后续翻译表达水平。
5’UTR区：
在真核细胞中核糖体亚基需要经过5UTR到达起始密码子AUG处,从而开始翻译，因此5UTR的长度和结构对翻译的起始意义非凡。设计要点如下：
（1）在设计mRNA时5UTR不能太长（紧密的二级结构会阻止核糖体与5’7Gcap结合）;
（2）应避免在5UTR区域引入上游开放阅读框序列（可能会抑制ORF区基因的表达，也可能导致mRNA的降解）和起始密码子AUG。
（3）在5UTR区域引入强的Kozak序列(GCCRCCAUGG,R代表嘌呤)，可以加强起始密码子的识别,让mRNA更容易被翻译
3’UTR区：
在合成的mRNA中应避免AU富集序列（AREs）和GU富集序列（GREs）序列，它们都是引起mRNA不稳定的常见因素。3UTR内的AU富集序列（AREs）是激活mRNA快速衰变的顺式作用序列,AREs上的AUUUA重复序列数量和位置对Poly（A）尾的缩短和RNA降解有关键影响。而该区域上的另一GU富集序列（GREs）,在哺乳动物细胞中能与CELF1蛋白结合从而加快mRNA的衰变。通过引入稳定元件，可以显著提高mRNA的稳定性，延长其半衰期。人类α和β球蛋白的3UTR可增强mRNA的稳定性和翻译效率，头尾排列的人类2个β-球蛋白的3UTR也可增加mRNA的稳定性。
真核生物mRNA结构与功能
五、耀海生物mRNA结构设计与优化平台
顺应时代洪流，耀海生物推出“RNASci”mRNA科研级样品制备服务平台。该平台包含四大技术模块：RNADes(mRNA结构设计与优化平台)、RNASyn(mRNA合成与修饰平台)、RNAPur(mRNA纯化平台)、RNAQua(mRNA质量分析与控制平台)，贯穿mRNA设计至成样的全生命周期。
耀海生物RNADes(mRNA结构设计与优化平台)平台技术内容：
5’UTR和3’UTR的优化设计；CDS区的优化设计；PolyA尾的优化设计。
深知UTR序列对mRNA稳定性以及后续翻译表达或调控表达等过程的重要性，耀海生物建立了天然UTR库，包含了常见高表达蛋白（如α-珠蛋白血红蛋白A1（HBA1））的UTR序列，多元化的UTR来源选择，可为针对不同品种匹配合适的UTR序列；同时可对天然5’UTR进行优化改造，帮助模板更高效地转录；并且采用国际前沿的设计策略优化终止密码子、PolyA尾等结构。
六、副产物给mRNA纯化带来挑战
在体外转录反应中，除产生符合预期长度的mRNA外,还会伴随一些副产物RNA如短的流产RNA（n-i）或更长的RNA（n+i）出现，这些副产物增加了纯化目标mRNA的难度。副产物RNA可能形成dsRNA,将导致机体产生强烈的免疫反应。目前mRNA主流纯化工艺是采用oligodT柱子（只选择性地结合有polyA尾巴的RNA），高盐浓度下，可以抑制携带负电荷的柱子配体和RNA之间的相互排斥，促进氢键形成。盐离子去除后，恢复柱子配体-RNA之间的负电荷之间的排斥，摧毁氢键，RNA被洗脱下来。
耀海生物RNAPurmRNA纯化平台技术内容：
LiCl沉淀纯化；
OligodT磁珠纯化；
层析柱工艺纯化。
耀海设置有多样化的纯化方式，切向流过滤、多种层析填料组成综合纯化方案，可有效去除mRNA粗品中的杂质，满足质量要求高的应用场景。
目前耀海生物mRNA平台可提供预制品eGFP（交付表达eGFP基因的mRNA成品），整个定制化mRNA制备周期（除序列合成委外）控制在一周左右，灵活的定制规模，可满足50μg~10mg的不同需求。
oligodT柱子
BIA柱子纯化mRNA出峰图
总结
IVTInVitroTranscription反应本身没有难度可言，但是如何实现产量的最大化，如何减少副产物的形成，如何实现高效的加帽率，如何得到高纯度的mRNA,这些都是需要从业人员一一去攻克的难关路漫漫其修远兮，愿我们上下而求索，建立起高产量高效率的mRNA合成纯化路线。
参考文献：
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