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#基因治疗#
前言
如果没有限制性内切酶，当今的分子生物学研究会是个什么样子？40年来，限制性内切酶这个幕后成员默默推动着许多基础生物学研究和商业化应用。限制性内切酶首先是在细菌体内发现的，但后来在部分古细菌中也发现了这种成分。限制性内切酶被称为DNA研究中的“手术刀”。通常，限制性内切酶会切割双链DNA。每个限制性内切酶会识别特定的DNA序列，识别序列长度通常4-8bp。不同类型的限制酶可在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA片段，酶切之后会形成粘性末端（5′或3′突出端）和平末端。不夸张地说，没有限制性内切酶的应用就没有基因工程的出现。
mRNA药物生产过程中，常使用质粒作为体外转录步骤中的DNA模板，质粒线性化是质粒DNA模板制备的重要环节。这是因为环状质粒缺乏有效的终止，而RNA聚合酶又具有很高的持续合成能力，若以环状质粒作为模板，会导致转录产生不同长度的RNA产物，因而为了有效转录形成特定长度的RNA，需要使用限制性内切酶对环状质粒进行彻底线性化。今天，菌菌带大家普及一下有关限制性内切酶的基础知识。
什么是限制性内切酶？
限制性内切酶（restrictionendonuclease，REases）是一种能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在特定位置切割DNA链中的磷酸二酯键的一类酶，简称限制酶。
常用的内切酶有BamHI、KpnI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等。不同的限制性内切酶会识别不同的DNA序列，它可以在识别序列内或距识别序列不远的位置处切割DNA，酶切之后会形成不同类型的产物，BamHI形成5′粘性末端产物，KpnI形成3′粘性末端产物，EcoRV形成平末端产物（图1）。
图1特定限制性内切酶切割后形成的粘性或平末端（5′或3′端）示意图。
限制性内切酶的命名规则
限制性内切酶的命名主要是根据细菌的属名、种名、菌株或血清型、发现的顺序而定，以BstEII为例1，命名规则如表1所示。
表1限制性内切酶的命名规则
限制性内切酶的分类
根据结构的复杂程度、识别序列、切割位点位置以及辅助因子要求，限制性内切酶分为四种类型：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ、TypeⅣ。表2汇总了各类限制酶的特点并列举了不同类型常见的酶。
表2限制性内切酶类别和特性
常用的II型限制性内切酶的识别序列
Ⅱ型限制性内切酶已经成为DNA分析和分子克隆等许多研究应用最常用的一类限制酶，它是分子质量较小的单体蛋白，识别和切割双链DNA分子时仅需要Mg2+存在即可。II型限制酶能够特异性识别四核苷酸或六核苷酸的旋转对称核酸序列（又称回文序列），并在识别区内特定的核苷酸处内切DNA双链中的磷酸二酯键，产生确定的限制片段和跑胶条带。常见的II型限制性内切酶的识别序列见表3。
表3常用的II型限制性内切酶的识别序列
星耀小TIP：
想要查找更多内切酶的识别序列，可以参考以下方法：1.所使用限制酶的公司的目录或者网站；2.软件如：PrimerPremier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了限制酶识别序列的信息；3.NEB的REBASE数据库。
II型限制性内切酶的亚型与切割机制
图2II型限制酶特定亚型的亚基组成和切割机制2（明亮的三角形代表切割位点）
目前经过鉴定的II型限制性内切酶超过3,种，这些酶又被进一步细分成IIP、IIA、IIB、IIC、IIS等子类别2。IIP型限制酶主要作为同源二聚体，同时切割两条DNA链。有些充当二聚体的二聚体（同源四聚体），切割两条DNA链。还有一些作为单体，一个接一个地分别切割DNA链。IIS型限制酶通常作为单体结合，但作为“瞬时”同源二聚体切割。IIB型限制酶在其识别序列的两侧进行切割,它们的亚基/结构域化学计量和多肽链连续性各不相同。图2显示了三个主要形式的示例：BcgI、AloI和HaeIV。这些形式组装成高阶低聚物以进行切割。IIB型限制酶在甲基化和切割位置方面表现出双边对称性。目前尚不清楚它们是在半序列边界的左侧还是右侧进行切割。IIG型限制酶（例如BcgI）可能在其结合的识别半位点的上游切割。所有其他IIG型限制酶（例如MmeI）从该位点下游切割，通常具有相同的几何形状。然而，这些蛋白质具有非常相似的氨基酸序列，这表明反应在某种程度上是相同的。IIT型限制酶在不对称序列内或附近切割。它们成分不同，有两个不同的催化位点。在某些情况下，两个亚基/结构域都与识别序列相互作用。在其他情况下，只有较大的亚基/结构域才能识别DNA。
IIS型限制酶克隆的优势
IIS型限制酶可以在离它的不对称识别位点一侧下游的特定距离处切割DNA双链，这是由于此类限制酶的识别序列和催化区域被一个连接多肽分开；IIS型限制酶的一个突出特点是对切割位点的序列没有要求，也就是可以识别序列外的任意核苷酸序列（常见IIS酶切位点如图3所示）3。
图3常见IIS限制酶酶切位点
使用IIS型限制酶进行分子克隆的优势如下：
·单一管中进行克隆：由于连接产物中酶切位点消失，所以酶切和连接可以在同一反应管中进行。
·无痕克隆：不会引入多余序列。
·同时组装多个片段：使用正确的互补末端组合可以同时组装多个片段。
结语
限制性内切酶的发现及应用开启了遗传学研究的新纪元。限制性内切酶为生命科学研究提供了重要工具，如DNA测序、基因工程等。现在临床的许多分子生物学诊断中，限制酶都是必备的工具，并因此成为现代医学中最为基本的应用试剂。希望菌菌今天的小课堂能够帮助大家对限制性内切酶有一个基础的了解。
参考文献
1.Smith,H.O.Nathans,D.Letter:Asuggestednomenclatureforbacterialhostmodificationandrestrictionsystemsandtheirenzymes.Journalofmolecularbiology81,-,doi:10./-(73)-6().
2.Pingoud,A.,Wilson,G.G.Wende,W.TypeIIrestrictionendonucleases--ahistoricalperspectiveandmore.Nucleicacidsresearch42,-,doi:10./nar/gku().
3.Engler,C.,Kandzia,R.Marillonnet,S.Aonepot,onestep,precisioncloningmethodwithhighthroughputcapability.PloSone3,e,doi:10./journal.pone.000().