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#蛋白质#
前言
蛋白质聚集（ProteinAggregation）是蛋白质发生错误折叠、构象改变而形成聚体的生物学现象。在蛋白类药物的发酵、纯化、制剂、储存、甚至给药过程中，蛋白质聚集的现象广泛存在，形成的聚体可能导致蛋白丧失活性、增加免疫原性，严重影响蛋白的质量指标和生产应用。在生物制药领域，蛋白质聚集是药物研发和商业化过程中的重要挑战。
年10月，拜尔公司联合特拉华大学RobertsCJ发表在InternationalJournalofPharmaceutics（1区,IF:6.）的文章：《Proteinaggregation-Mechanisms,detection,andcontrol》，详细阐述了蛋白质聚体的形成机制、影响因素、及聚体的检测与控制方法。
作为重组蛋白类CDMO从业人员，菌菌仔细阅读了该篇文章，颇有受益，故将文章内容分享如下：
蛋白质聚体的形成机制
蛋白质聚集通常经过一系列由内而外的变化过程。首先，蛋白质的内部结构发生改变，影响蛋白-蛋白间的相互作用，导致二聚体或寡聚体的形成，随后聚体生长或聚集，形成可见颗粒。
初始寡聚化/成核（Initialoligomerization/nucleation）
蛋白质存在固有构象扭曲或局部构象不稳定的现象，这类结构变化可能暴露聚集倾向性序列或“热点序列（hotspot）”，形成易于聚集的单体，进而与其他单体结合形成二聚体或寡聚体，作为初始聚集事件，也称成核。
据文献报道，这些“热点序列”位于蛋白的不同区域，如单克隆抗体的Fab结构域。如图1所示，一个折叠的单克隆抗体包含两个相同的抗原结合Fab结构域和一个保守的Fc结构域，其中Fab结构域包含决定抗原表位特异性和亲和力的氨基酸序列，通常需要一定程度的构象扭曲或“错误折叠”，这一构象变化导致聚合倾向性的氨基酸延伸（即“热点序列”）暴露出来，从而诱导蛋白质单体聚集成可溶性寡聚体或多聚体。
蛋白质是带电荷的两性聚合物，可在不同的浓度和溶剂条件下，合成不同大小的寡聚体。蛋白质聚集过程可能涉及多种类型的蛋白间相互作用，如疏水作用、静电作用、氢键、范德华力。据报道，蛋白质浓度增加会缩小蛋白间的空间距离，从而使蛋白质彼此“靠近”，促进单体缔合产生寡聚体或多聚体，即蛋白间相互作用具有浓度依赖性。低pH、不稳定剂/有机溶剂或压力等不当的溶剂条件可能导致蛋白质的局部构象不稳定，蛋白聚体的初始成核速率与构象的稳定性和柔性相关。
图1:单克隆抗体的聚合示意图
聚体生长（Aggregategrowth）
寡聚体成核后生长成较大的多聚体，这一过程为聚体生长，可通过多种机制发生，包括单体加成、链式聚集、聚体-聚体（或聚簇-聚簇）间相互作用或凝聚。与成核类似，聚体的生长也受蛋白构象稳定性或胶体稳定性的影响。
由于成核和初始聚体的数目随时间的延长而增加，聚体生长呈指数增长，如下图所示。随着蛋白质聚体的不断增大，最终形成不溶性颗粒，其形态多样性与疏水性或芳香族氨基酸的相对数量和聚合阶段有关。有研究显示，随着时间的推移，不溶性蛋白颗粒会部分解离为可溶性聚合物。
图2:蛋白质聚体的形成示意图
蛋白质聚集的影响因素
蛋白结构（Proteinstructures）
蛋白质的一级序列和疏水氨基酸的占比，可影响聚合速率与聚体的稳定性。有研究报道，疏水氨基酸可形成聚集倾向序列，将亲水氨基酸替换为疏水氨基酸或不同疏水氨基酸的替换可显著增加蛋白质的聚集率。
蛋白质的二级结构可控制其聚集倾向。有研究显示，冻干诱导的蛋白聚集与β-折叠有关。对于存在游离二硫键的蛋白质，其二级结构影响硫醇-二硫键交换的速率，从而影响化学介导的聚集速率。
蛋白质的三级结构也影响蛋白质的聚集。疏水基团等聚集倾向性区域促进蛋白质的聚集，可使用带电残基或脯氨酸包埋以减少蛋白聚集。
蛋白质的糖基化修饰可维持蛋白质的稳定性。关于单克隆抗体的研究显示，CH2结构域的糖基化可维持CH2结构域及整个单抗分子的稳定性。同时，单抗的去糖基化会破坏CH2区域的三级结构，使Fab和Fc区域不稳定，加速聚体的产生。此外，糖链结构也通过影响蛋白构象的稳定性而改变蛋白质的聚集倾向。
化学降解（Chemicaldegradation）
蛋白质的降解途径有氧化、光照、脱酰胺、结晶或去二硫键，可通过改变蛋白构象或胶体稳定性，从而影响蛋白质的聚集效应。
蛋白质的氧化可增强聚集倾向，主要归因于：
①蛋白表面疏水性增强；
②聚体间相互作用增强；
③蛋白质构象稳定性降低。
蛋白质的糖基化可将表面正电荷转化为中性或负电荷，放大其暴露的疏水表面。另一方面，广泛地糖基化可阻止蛋白质聚集，对蛋白质进行糖基化修饰是减少蛋白质聚集的一种策略。
蛋白质的脱酰胺可增强聚集倾向，归因于脱酰胺化引入负电荷，潜在改变蛋白间的静电作用。
抗体-药物偶联（ADC,Antibody-drugconjugates）对蛋白的影响在少数研究中有报道，小分子疏水药物增加了蛋白质的疏水表面，影响蛋白质的构象稳定性。因此，随着药物-抗体比的增加，蛋白的聚集效应逐渐增强。
温度（Temperature）
有研究报道，温度过高可加速蛋白质的聚集过程，主要通过去折叠蛋白的占比和蛋白的扩散和碰撞速率。同样，温度过低也可能导致蛋白质的去折叠，增强聚集效应。温度主要通过改变溶剂的性质影响蛋白质的聚集，包括蛋白扩散速率、蛋白间相互作用、蛋白或聚体的溶解性、构象稳定性和化学降解。
溶剂条件（Solutionconditions）
溶液pH会影响蛋白的构象和胶体稳定性，从而影响蛋白质的聚集。改变溶液pH可改变蛋白间相互作用、蛋白聚体的溶解度、蛋白质交联反应及聚体的成核和生长。
离子强度是蛋白聚集的另一影响因素，主要通过影响构象稳定性、蛋白间相互作用实现。盐溶液中阳离子和阴离子能与蛋白分子发生特异性结合，可用来调节蛋白质的聚集。
配方辅料或添加剂可影响蛋白间相互作用，常用于减少蛋白质在体积溶液中的聚集，而在某些条件下，添加剂会增强蛋白的聚集。
制备过程（Processes）
冷冻可诱导蛋白聚集，由于低温诱导的变性或结构不稳定、冰诱导的蛋白质吸附或变性、部分成分的选择性结晶、蛋白浓度等因素。
机械作用：离心、过滤、搅拌及泵送可诱导蛋白质或多肽的聚集效应，归因于形成气液界面发生蛋白吸附、去折叠与聚集，以及剪切应力、疏水表面暴露，如搅拌棒和研磨搅拌。
光照可在蛋白质中诱导多种光解和非光解的产物，这些降解产物中可能包括具有增强聚集倾向的聚集体或单体。研究表明，在某些情况下，抗体溶液暴露在紫外线或可见光下会形成高分子量聚集体。
发酵过程中培养基条件、细胞密度、诱导温度等会影响蛋白的折叠修饰，从而促进聚体形成，常见的案例有大肠杆菌发酵中形成包涵体。
纯化过程中洗脱溶剂（pH、盐浓度）、色谱柱配体与骨架可能导致聚体形成。使用ProteinA亲和层析过程中，较低的pH值可能影响蛋白的稳定性；疏水层析过程中层析填料与蛋白间的强疏水作用也可能导致聚体形成。
干燥过程会去除少量蛋白质水化层，会导致蛋白质的聚集。一些蛋白质在冻干或喷雾干燥过程中形成聚体。
蛋白质聚体的检测
可溶性聚体
可溶性蛋白聚体可使用体积排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）检测，年版本的《中国药典》推荐：SEC-HPLC用于人血白蛋白多聚体与人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体的测定，流动相为含1%异丙醇的0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）为流动相，上样量要求为20μl浓度为12mg/ml的待测样品。
该方法可检测大多蛋白聚体，但也存在一定的局限性，包括样品在色谱柱中稀释导致的聚体解离、流动相或高压诱导的蛋白质聚集、系统有限的分辨率和分析范围（＜MDa）。其他可选方法包括原位动态光散射（DLS）、泰勒色散分析（TDA）、原子力显微技术、电喷雾差分迁移率分析（ES-DMA）等。
图3:人血白蛋白多聚体的检测图谱（SEC-HPLC）
不溶性聚体
不溶性聚体包括亚可见颗粒（μm）、可见颗粒或聚体，其中亚可见颗粒采用光遮蔽法测量大小和含量，可用于检测2μm的颗粒。流动成像分析方法可实现半透明或不规则形状颗粒的精准检测，是当前广泛使用的分析方法。其他新开发的分析方法包括纳米颗粒跟踪分析（NTA）、共振质量测量（RMM）、成像流式细胞术（IFC）、自动荧光显微镜成像（aFMI）等。
可见颗粒的常用检测方法是外观检查，由于可见颗粒大小和形态的多样性，难以实现定量分析。另一种可见聚体的分析方法是凝胶化——半透明或浑浊。当溶液条件有利于弱吸引力的蛋白质-蛋白质或颗粒-颗粒间相互作用时，例如溶液pH接近蛋白等电点（pI）时，易发生凝胶化。
蛋白质聚体的控制
“热点序列”的去除或修饰
通过分析蛋白质及疏水表面，利用基因工程/蛋白质工程去除或修饰“热点序列”，可减少蛋白质的聚集。据报道，单个位点的突变（点突变）可有效减少蛋白质的聚集。聚乙二醇化（PEG化）、糖基化等亲水性结构修饰可隐藏“热点序列”，从而达到减少蛋白质聚集的效果。
制剂配方的设计
为避免结构修饰对蛋白活性的影响，研发人员常选择调整pH、离子强度和稳定剂等制剂配方稳定蛋白质的结构。
表面活性剂是一种常用的蛋白稳定剂，包括聚山梨酯、Pluoronics、烷基糖、氨基酸衍生物，也可用作稀释剂减少蛋白重构引起的聚集。表面活性剂减少蛋白聚集的机理为：通过减少蛋白质的自缔合与蛋白质间弱相互作用。
糖类是另一种常用的蛋白稳定剂，通过增强蛋白质的构象稳定减少聚集，如海藻糖或蔗糖。
其他蛋白稳定剂包括多元醇、氨基酸（如精氨酸和组氨酸）、多胺（如腐胺和亚精胺）、碱性氨基酸的肽类树状体、高分子聚合物、环糊精、RNA适配体和EDTA。不同稳定剂作用机制不同，需结合实际需求选择合适的稳定剂。
冻干工艺
由于冻干工艺本身存在诱导蛋白质聚集的风险，因此需优化冻干工艺以最大限度地减少蛋白聚集，包括保护剂和冻干过程的设计。例如，冷冻后退火可降低免疫球蛋白的表面分数，从而维持蛋白存储期间的稳定性；添加吐温80、海藻糖或聚山梨醇酯作为保护剂可减少颗粒物的形成。
液体静压
超高压可用于控制蛋白质聚集。研究显示，向绿色荧光蛋白包涵体施加高压（约2-3kbar）30分钟，可使多数聚体分离。高压与高温的结合（70°C下2kbar）可分离生长激素聚体及颗粒，但缺点是高温易促进蛋白降解。
过滤
为确保蛋白制剂生产放行后和/或经过保质期后产生聚体，如给药前用生理盐水或5%葡萄糖溶液稀释药品，可能会产生蛋白质聚集体或颗粒。因此，部分已上市蛋白类药品在制备或给药时需使用滤器过滤，去除蛋白质颗粒物。
结语
如上文所述，蛋白质聚集普遍存在于蛋白类产品制备的各个阶段，对产品质量、药效和安全性造成潜在不良影响。蛋白质聚集过程包括成核和聚体生长，受蛋白结构、氧化、温度、溶液pH、离子强度等多种因素影响。对于易形成聚体的蛋白（如疏水性蛋白），上游分子构建人员可通过基因工程的方法，预测蛋白结构模型，对“热点序列”加以修饰或去除。中下游人员可通过发酵、纯化及制剂工艺的开发和优化，最大程度地减少聚体的形成。
参考文献
[1]WangW,RobertsCJ.Proteinaggregation-Mechanisms,detection,andcontrol.IntJPharm.Oct25;(1-2):-.doi:10./j.ijpharm..08..
[2]RobertsCJ.Therapeuticproteinaggregation:mechanisms,design,andcontrol.TrendsBiotechnol.Jul;32(7):-80.doi:10./j.tibtech..05..
[3]ChandelTI,ZamanM,KhanMV,etal.Amechanisticinsightintoprotein-ligandinteraction,folding,misfolding,aggregationandinhibitionofproteinaggregates:Anoverview.IntJBiolMacromol.Jan;:-.doi:10./j.ijbiomac..07..