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前言
环状RNA(circRNA)是一类单链闭合的RNA分子，由mRNA前体（pre-mRNA）通过可变剪接（AS,AlternativeSplicing，外显子环化或内含子环化）产生，内源性circRNA包括编码或非编码性RNA，不包含5端帽结构(Cap)和3端polyA尾，缺乏游离末端，因此不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定。
自年在植物类病毒中首次发现单链闭合的环状RNA(circRNA)，circRNA的特征和生物学功能不断被挖掘。基于共价闭合的环状结构，circRNA缺乏游离末端，不易被核酸外切酶降解。此外，由于其结构和序列特异性，circRNA在体内发挥重要的生物学作用，包括微小RNA（miRNA,microRNA）或蛋白分子海绵、与mRNA相互作用、翻译蛋白或多肽。
前期菌菌已分享了circRNA的基础介绍、以及circRNA作为miRNA或蛋白分子海绵的功能及潜在应用，感兴趣的小伙伴可戳链接查看：一文读懂：环状RNA(circRNA)的基础研究与治疗应用进展；环状RNA的miRNA分子海绵功能；环状RNA蛋白海绵作用。
对circRNA的深度研究自然离不开circRNA的体外制备，以进一步验证其生物学功能，其中体外环化是一个必要过程。今天菌菌将分享当前较为成熟的RNA体外环化方法。
RNA体外环化方法的发展史
以下为环状RNA(circRNA)相关研究的里程碑事件：
年，在植物类病毒中首次发现单链闭合的circRNA，提出了环状RNA这一概念。随后，研究者先后在真核生物、人丁型肝炎病毒(HDV)和人体细胞中鉴定了circRNA；
年，研究报道在内部核糖体进入位点（IRES）的助力下，可实现工程化circRNA的异源表达。而由于观察到的circRNA的表达水平低，研究人员认为circRNA是异常的RNA剪接产物；
年之后，随着高通量测序技术的发展，在人体细胞中发现大量的circRNA，并发现了circRNA作为miRNA海绵的功能，且circRNA不易被RNA外切酶降解，结构较线性RNA更稳定。研究人员对circRNA展开了深度的探索，circRNA相关研究方法不断建立。
随着学者们对circRNA的研究热度，circRNA的体外制备方法也逐渐发展起来。年，Sokolova等通过化学连接法制备circRNA。随后Moore等通过T4DNA连接酶合成circRNA，随后又有研究报道通过T4RNA连接酶1或T4RNA连接酶2制备circRNA，或基于内含子自剪接功能的排列内含子外显子法(PIE,permutedintronsandexons)实现RNA的环化。
年，麻省理工学院Anderson通过优化PIE系统，在两端添加同源臂，实现了5kb序列的环化。
年，北大魏文胜课题组基于circRNA平台，制备得到高度稳定的circRNA，成功在小鼠和恒河猴中诱导针对SARS-CoV-2的中和抗体和特异性免疫反应。
年，清华大学林欣和喻国灿团队基于circRNA平台，设计了编码肿瘤抗原的circRNA疫苗，在动物模型中显示很好的抗肿瘤疗效。
同时，随着工业界circRNA平台的搭建和布局，如OrnaTherapeutics、Laronde、圆因生物、环码生物、科锐迈德、吉赛生物和耀海生物，circRNA研究热度前所未有。
图1:环状RNA的发展历程
RNA的体外环化方法
以线性RNA为前体，目前体外合成环状RNA(circRNA)的常用思路是将两个末端连接，形成共价闭合的环状结构，可基于化学连接、酶法连接或核酶剪接作用实现，详细介绍如下：
化学连接法
线性RNA的化学连接可通过溴化氰(BrCN)或1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)实现。化学连接法存在一个较严重的问题，由于磷酸迁移会形成2’-5’-磷酸键，而非天然的3-5磷酸二酯键。在寡核苷酸的3’端使用2’脱氧核苷酸进行连接或环化，可有效避免2’-5’-磷酸键的形成。
图2:通过化学连接法实现RNA的环化
酶法连接
常用于RNA环化的酶有3种：T4DNA连接酶1(T4Dnl1)、T4RNA连接酶1(T4Rnl1)和T4RNA连接酶2(T4Rnl2)。
图3:通过酶法连接实现RNA的环化
T4DNA连接酶1：
以ATP为辅助因子，可将双链DNA、双链RNA或DNA-RNA杂交链的缺口进行连接。单链RNA的环化实验中，通常设计与RNA缺口两端序列互补配对的DNA夹板(splint)，创建一个局部的杂交双链，该杂交结构可被T4DNA连接酶1识别，连接5’端与3’端形成磷酸二酯键，从而得到环化的RNA。由于T4DNA连接酶I在RNA底物上的周转效率较低，需大量的酶来实现RNA的连接。
T4RNA连接酶1：
以ATP作为辅助因子，支持单链RNA或单链DNA的连接。在RNA的二级结构作用下使两端的5’-磷酸与3’-OH靠近，并在T4RNA连接酶作用下实现连接。连接酶对5’末端和3’末端核苷酸有不同的偏好，3’端核苷酸偏好性依次为：AG≥CU，5’端核苷酸偏好性依次为：pCpUpApG。除RNA二级结构的辅助作用外，也可设计RNA夹板使两端靠近，需设计不完全互补的夹板序列，在两个末端的2-3个核苷酸处保持单链状态。
T4RNA连接酶2：依赖于ATP，可将RNA的3’-OH与RNA或DNA的5’-磷酸基团连接，尤其是对双链RNA的连接效率最高，通常设计互补的DNA或RNA夹板来促进分子内的连接效率。有研究者发现了不依赖夹板的T4RNA连接酶2环化策略，通过排列线性RNA前体的序列，使3’端位于双链区域内，实现了短序列RNA的环化，该方法需在线性RNA前体的3’端添加至少3个连续的碱基对，因此可能应用于不同大小、不同结构RNA的环化。
小结：用于RNA环化的以上三种酶T4DNA连接酶1(T4Dnl1)、T4RNA连接酶1(T4Rnl1)和T4RNA连接酶2(T4Rnl2)都是ATP依赖性的，通过3个核苷酸转移步骤催化RNA末端5’-磷酸和3’-OH的连接，将RNA分子内两端连接可产生circRNA。
①连接酶与ATP反应形成酶-AMP复合中间体；
②AMP脱离酶-AMP复合体，与RNA的5’-磷酸结合，形成5’端腺苷化的RNA；
③5’端腺苷化的RNA与3’-OH连接形成磷酸二酯键，释放AMP。
星耀小TIP：用于体外酶促环化的RNA分子5’端含一个单磷酸基团，而非体外转录(IVT)产生的三磷酸基团，以下3种方法可将三磷酸基团替换为单磷酸基团：①在IVT反应中，单磷酸鸟苷(GMP)以更高的摩尔比添加到三磷酸鸟苷(GTP)中，利用GMP合成RNA；②通过去磷酸化和磷酸化反应去除5’端三磷酸基团，添加单磷酸基团；③使用RNA5’焦磷酸水解酶(RppH)处理GTP-RNA，将三磷酸基团水解，产生单磷酸基团。
核酶法
核酶是具有酶催化作用的一类RNA，应用于RNA环化的有PIE系统（I型内含子或II型内含子）和其他核酶。PIE系统是一种较常用的方法，基于I型或II型内含子的自剪接功能，在镁离子和游离GTP存在下，达到剪接效应，导致内含子的环化及中间序列的连接，从而产生circRNA。
PIE系统-I型内含子自剪接：
利用T4td基因或鱼腥藻tRNALeu前体基因设计排列内含子外显子(PIE)结构，排列方式为：将RNA内含子与辅助外显子片段分为两部分，其中5’端序列转移到目标序列的尾部，3’段序列插入目标序列的前端，在GTP存在下，这种PIE结构会导致除内含子外序列的自环化。有研究报道，基于鱼腥藻tRNA前体基因设计PIE结构，结合合理的环化率提升策略（如添加同源臂序列），可实现长达5kb序列的环化。常规的PIE环化法会保留辅助外显子序列，为改善这一不足，研究者筛选了类似辅助外显子序列的RNA序列，以制备无外源基因的circRNA。
PIE系统-II型内含子自剪接：
与I型内含子类似，基于内含子的自剪接功能实现环化。II型内含子来源于酵母线粒体基因组。与I型内含子PIE系统相比，使用II型内含子不需辅助外显子序列，即可产生预期的circRNA序列，该方法的广泛适用性仍需更多研究验证。
图4:基于PIE系统实现RNA的环化
发夹核酶：发夹核酶(Hairpinribozymes)来源于类病毒和丁型肝炎病毒等亚病毒因子，以单链DNA模板进行滚环转录反应，生成一个长链重复的线性RNA前体，通过自我切割形成小的circRNA。该方法可用于制备大量50-nt的circRNA，但由于核酶序列同时存在于circRNA序列中，可能存在脱靶效应。
图5:基于发夹核酶实现RNA的环化
结语
总结来看，不同体外环化方法的特征如下表所示：
在长序列环状RNA(circRNA)的制备方面，PIE系统具有很大优势，也是当前circRNA企业的主打平台。据公开资料显示，国内外布局circRNA治疗平台的企业包括OrnaTherapeutics、Laronde、圆因生物、环码生物和科锐迈德。国内药物合同研发（CRO）公司有耀海生物、吉赛生物，产品管线大多基于circRNA的蛋白编码功能，作为一种通用平台用于传染病、肿瘤、蛋白替代治疗、遗传病、细胞治疗等领域。然而各公司的环化技术不尽相同，如OrnaTherapeutics基于核酶(PIE)的oRNA平台，圆因生物AnaPIE平台，环码生物II型内含子自剪接系统，科锐迈德（CureMed）Clean-PIEI型内含子自剪接系统，吉赛生物T4RNA连接酶成环系统，以及耀海生物PIE成环系统。
环状RNA(circRNA)作为一种新兴生物学技术，国内外circRNA企业的差距并不遥远，相信在不远的将来，circRNA技术将成为科研与工业领域的热门，建立一种全新的“程序化药物平台”，有望取代或增强现有的药物研发模式。
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