前言
年7月，广州多家研究机构科研人员在EuropeanRespiratoryJournal期刊发表了题为“Metabolomicanalysesrevealsnewstage-specificfeaturesoftheCOVID-19”的研究成果，该研究以新冠肺炎患者为研究对象，运用非靶向和靶向代谢组学研究方法，提供了新冠肺炎患者所有阶段循环代谢物特征的综合视图，并确定糖代谢和尿素循环的代谢重新编程是新冠肺炎的潜在病理机制；提出以宿主代谢为靶点可能是在病程不同阶段对抗新冠肺炎的一种可行的方法。
中文标题：代谢组学分析揭示了COVID-19新的发展特征
研究对象：新冠肺炎患者
发表期刊：EuropeanRespiratoryJournal
影响因子：16.
发表时间：.7.21
运用生物技术：LC-MS非靶代谢组学+靶向代谢组学
研究背景
新冠肺炎已经感染了1.6亿多人，并导致全世界数以百万的人死亡；至少部分原因是它的病理生理尚不清楚。所以，识别新冠肺炎的潜在分子机制对于战胜疫情是至关重要的。此外，代谢物通过在疾病进展过程中获得广泛的病理生理学意义来反映个体的疾病进展。
因此，中国广州多家研究机构的科研人员使用了非靶向和靶向代谢组学分析对新冠肺炎患者所有阶段血清的代谢特征进行了全面的观察。与健康对照组比较，在发现队列和验证队列中，轻度、重度和恢复期循环代谢物的变化模式不同，提示糖代谢和尿素循环的代谢重编程是新冠肺炎进展的潜在病理机制。
研究思路
研究结果
1.COVID-19发展阶段患者血清的非靶向代谢组学分析
通过与轻症患者相比，发现重症患者淋巴细胞明显抑制，白细胞和AST升高，提示免疫系统和肝功能紊乱。（AST即天冬氨酸氨基转移酶，它在血液中水平较低,当身体组织或器官患病或受损时，细胞会产生AST并释放到血液中去；可用于评估肝脏损伤情况）。
非靶向代谢组学分析中，发现队列中的样品共鉴定出个代谢物峰，负离子模式个、正离子模式下的个；通过筛选，鉴定出种代谢物。轻症组的代谢物与正常组部分重合，而重症组和恢复组很容易区分(图1B)。个代谢物中有个与COVID-19显著相关(图1C)。火山图显示了不同组代谢物与正常组相比上调下调的情况(图1D)；与正常组对比，显著上调的代谢物：轻症组有48个，严重组有59个，恢复组有64个；显著下调的代谢物：轻症组有33个，重症组有29个，恢复组有34个。在重要的代谢物中，谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸、鸟氨酸、犬嘌呤、色氨酸等多种氨基酸与疾病的严重程度相关；参与TCA循环的葡萄糖、乳酸、丙酮酸等代谢物随着COVID-19的进展表现出紊乱。
结果表明，在COVID-19进展过程中，参与氮代谢、TCA循环、脂肪酸代谢等途径的代谢产物是不平衡的。
图1
发现队列所有COVID-19发展阶段患者血清的非靶向代谢组学分析。
（B）四组非靶向代谢组学的主成分分析（PCA）。
（C）种代谢物热图（FDR0.05，FDR的含义是错误拒绝(拒绝真的(原)假设)的个数占所有被拒绝的原假设个数的比例的期望值）。
（D）火山图。（红色为显著上调，蓝色为显著下调，FDR0.05,Log2(FC)0.25或-0.25,OPLS-DAVIP1。）
2.靶向代谢组学揭示了COVID-19患者的代谢物变化趋势
使用靶向代谢组学分析；首先根据发现队列中59名受试者的血清代谢物(4个样本因体积小而被排除)；定量到了种代谢物。根据不同组的浓度，将个代谢物分为16个簇；然后根据恢复组的代谢物是否恢复到正常水平将这些簇分为三组(图S3)。
图S3
靶向代谢组学揭示了发现队列不同阶段代谢物变化趋势。
图S3A中代谢物的浓度随疾病发展而升高，恢复组维持在较高水平；
图S3B中代谢物的浓度随着疾病发展而降低，恢复组比正常水平低；
图S3C中代谢物浓度恢复到接近正常水平。
图S4
从发现队列中获得的血清进行靶向代谢组学分析。
（A）火山图（突出了与正常组相比，轻度组、重度组和恢复组受试者的代谢物差异）。
（B）轻度组、重度组、恢复组与正常组比较的OPLS-DA评分图。
（C）用于评价OPLS-DA模型质量的排列检验。
将COVID-19不同阶段与健康组的代谢组学图谱进行了比较，以确定和描述涉及COVID-19进展的特定代谢物和代谢途径。重点研究了COVID-19不同阶段与正常组之间的差异。OPLS-DA模型的Q和R一般采用0.5的显著性阈值。以下各组差异明显：正常组与轻度组，RY=0.、QY=0.；正常与严重，RY=0.、QY=0.79；正常组与恢复组，RY=0.、QY=0.(图S4)。此外，我们定量了另外名受试者的血清代谢物作为独立验证。采用相同的模型，结果一致性高(图S5)。
图S5
从验证队列中获得的血清进行靶向代谢组学分析。
（A）火山图（突出了与正常组相比，轻度组、重度组和恢复组受试者的代谢物差异）。
（B）轻度组、重度组、恢复组与正常组比较的OPLS-DA评分图。
（C）用于评价OPLS-DA模型质量的排列检验。
3.不同阶段主要代谢物及通路变化
与正常组相比，在靶向代谢组学测定的个代谢物中，有80个在至少一个阶段显示出显著差异(FDR0.05)(图2A)。SMPDB和KEGG通路分析显示天冬氨酸代谢、尿素循环、精氨酸和脯氨酸代谢、甘氨酸和丝氨酸代谢、TCA循环失调(图2B)。特别是精氨酸和鸟氨酸出现了明显的下降或增加(图2-b，图6)，这两种成分都是尿素循环中的关键成分。
三羧酸循环、丙酮酸代谢和糖酵解的改变共同表明了能量代谢紊乱，重症组极高的乳酸水平支持了这一结论。这可能是因为即使有呼吸支持，患者仍无法有效获取氧气，从而对能量代谢造成巨大障碍。这一现象也在经历重症进入恢复组的患者中发现，表明即使新冠病毒被完全清除，损害仍然存在一段时间或很长时间(图2B)。
图2
发现队列不同阶段血清主要代谢物的变化。
（A）靶向代谢组学定量的代谢物热图。
（B）通路分析表明了氨基酸代谢的显著差异（路径中的每个框代表1个代谢物，如果在靶向代谢组学中发现，则用红色标记，如果在非靶向代谢组学中发现，则用黄色标记。条形图显示正常、轻度、重度、恢复期代谢产物的平均绝对浓度(从左至右)。绿色代表有机酸；橙色代表氨基酸；紫色表示碳水化合物，蓝色表示短链脂肪酸）。
4.COVID-19发展中尿素循环和TCA循环失调
负责氨基酸代谢的尿素循环和负责能量代谢的TCA循环为最受影响的代谢通路(图3)。在发现队列中，11种代谢物(属于或是与这两个通路密切相关)，在不同组间具有显著变化(图3)。在验证队列中，11种代谢物中有9种在不同组间有显著变化(图3)。这9种代谢物是肌酸、精氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、丙酮酸、苹果酸、瓜氨酸、谷氨酰胺和2-酮戊二酸。
与正常组相比，2-酮戊二酸、天冬氨酸和鸟氨酸水平显著增加；苹果酸和2-酮戊二酸在重度组中含量最高，提示TCA周期受到严重影响；在尿素循环中起关键作用的鸟氨酸持续增加，在恢复组达到最高水平；与正常组相比，重症组尿素循环中另一重要氨基酸精氨酸水平明显下降，提示新冠肺炎进展过程中尿素循环失调。
图3
尿素循环和TCA循环的失调可能参与了病理进展。
箱线图显示了不同阶段发现和验证队列的样本中这些代谢物的水平。发现队列和验证队列的代谢组学路径分析均发现，尿素循环和TCA循环是影响COVID-19患者的两种主要途径。星号表示差异有统计学意义，p值：*，0.05；**，0.01；**，*0.。箱形图中的颜色代表不同的阶段:蓝色代表正常;橙色代表温和;红色代表严重；黄色代表恢复。
5.血清代谢物组合可能是潜在的预测生物标志物
为了研究这9种代谢物是否可以作为COVID-19患者风险分层的生物标志物，使用发现队列训练了几个经典模型(包括决策树、随机森林、支持向量机、以及逻辑回归)，并使用验证队列进行了验证；其中逻辑回归模型表现较好。使用上述9种代谢物的不同组合和整个研究参与者的数据(发现队列+验证队列)，发现代谢物越多，任何两组之间的所有区别观察到的分类值越高(图4A-F)。
然而，在疾病进展过程中循环代谢物的改变模式是不同的。例如，当使用较少的代谢物时，该模型可以区分严重和正常，准确率相对较高，但不能区分轻度和正常(图4-G)。随着代谢物数量的增加，该模型区分轻度和重度的准确性有所提高(图4G-I)。此外，相对较高的AUC值来区分恢复和正常，也表明在严重情况下幸存的受试者可能仍然遭受与代谢条件有关的长期附带损害。
为了更好地验证发现，将这9种代谢物与Shen等人的结果进行了比较，发现有4种代谢物存在重叠：苹果酸、丙酮酸、瓜氨酸和谷氨酰胺。然后我们用这4种代谢物作为特征建立逻辑回归模型，并使用发现队列和验证队列进行训练。然后利用Shen等人论文数据发表的结果对该模型进行了验证，在区分严重和正常方面取得了良好的效果(图S13)，证明该模型在各个研究中都是成立的。上述结果提示，苹果酸、丙酮酸、瓜氨酸和谷氨酰胺可能作为COVID-19重症患者危险分层的潜在生物标志物。
图4
尿素循环和TCA循环中9种显著改变的代谢物组合模型的AUC。
（A-F）使用1—9种代谢物区分不同阶段的AUC散点图。（x轴显示模型中使用的代谢物的数量；建立所有可能组合的模型，每个点表示单个组合的AUC。）
（G-I）使用3、5和7种代谢物的模型的平均AUC图。
图S13
使用Shen等的数据验证逻辑回归模型的AUC
6.COVID-19发展过程中的三种细胞因子
病毒防御降低与大量炎症细胞因子的产生是COVID-19的特征。为了显示队列中炎症标志物的变化，从每组中选取了18个容量充足的样本，检测了IL-6、TNF-α和IL-1β水平，这3个指标均与COVID-19感染有关。
与对照相比，IL-1β水平在重症组最高，恢复组低很多，但仍高于对照组(图S14-A)。IL-6和TNF-α的趋势相同(图S14-B和图S14-C)。这些结果提示，炎症水平与COVID-19疾病的发展密切相关，可能与代谢物的产生有关。因此，进一步进行相关分析，相关性分析发现天冬氨酸、肌酸、苹果酸和2-酮戊二酸的水平与细胞因子的表达呈正相关(图S15)。
图S14
验证队列中不同组血清中IL-1β、TNF-α和IL-6三种因子水平的检测。
（A）IL-1β。
（B）TNF-α。
（C）IL-6。
图S15
正常组、轻度组、重度组、恢复组9种代谢物与3种细胞因子的相关性分析。
在9种代谢物中，天冬氨酸与TNF-α呈正相关，苹果酸和肌酸与IL-6和IL-1β呈正相关。2-酮戊二酸与三种细胞因子均呈正相关。
图7
AC和AL对自噬介导的脂质清除的影响
相关讨论
本研究首次系统全面地提供了COVID-19患者各阶段，特别是恢复期血清代谢特征的观点。对COVID-19患者血清的靶向和非靶向代谢组学分析，发现了轻度、重度和恢复期循环代谢物的不同改变模式。感染新冠病毒的患者多数病情轻，部分患者病情发展为重症或危重症。这些重症型和恢复型病例是由宿主对感染的反应驱动的，从而导致多系统功能障碍和病理。对COVID-19患者各阶段循环代谢产物的综合分析，有助于制定综合策略，更好地治疗该疾病。
与正常水平相比，苹果酸、2-酮戊二酸和天冬氨酸等循环代谢物均有所升高，提示糖代谢异常和TCA循环可能对COVID-19疾病过程中的易感、严重程度和恢复至关重要。葡萄糖要么通过有氧代谢为多种生物过程提供能量，要么通过戊糖磷酸途径氧化生成NADPH维持氧化还原稳态，参与宿主在有氧条件下对抗致病微生物的免疫应答。而在COVID-19患者最常见的无氧状态下，葡萄糖经过糖酵解和发酵生成乳酸，ATP生成量有限，导致血乳酸和LDH水平升高。
发现表明，除了大多数COVID-19患者通常发生的厌氧糖酵解外，TCA循环在疾病的所有阶段也都增强了。提出SARS-CoV-2病毒劫持宿主机制，包括葡萄糖代谢，以促进COVID-19的发病机制。
在数据集中，与健康对照组相比，COVID-19患者血清中精氨酸水平明显下降，这与其他团队的研究结果一致。精氨酸既可以通过精氨酸酶转化为鸟氨酸和尿素，也可以通过一氧化氮合酶转化为一氧化氮和瓜氨酸。据报道，一氧化氮或其衍生物影响SARS-CoV的S蛋白与其同源受体血管紧张素转换酶Ⅱ的融合，并在病毒复制的早期步骤中减少病毒RNA的产生。因此，研究SARS-COV-2感染是否通过将代谢途径转换为尿素循环来减少一氧化氮的生成，以保持病毒复制，这将是有趣的。
虽然在本次研究中分别成功招募了63例和例患者作为发现队列和验证队列，但为了获得最好的可靠性，队列的规模仍然相对较小。为了证实发现，可能需要对来自更大规模COVID-19队列的血清样本进行代谢分析。然而，验证队列和发现队列的高一致性进一步巩固了研究的结果。此外，队列中还有一些重要的参数没有匹配。例如，重症病例多发生在老年人。虽然对照组、轻度组、恢复组之间没有显著差异，但轻度组、恢复组与重度组之间确实存在自然的不匹配，在解释结果时应考虑到这一点。
研究结论
在这项研究中，代谢组学数据提供了COVID-19患者各阶段循环代谢物特征的综合观点，并确定了葡萄糖代谢和尿素循环的代谢重编程是COVID-19的潜在病理机制。在新冠肺炎病程的不同阶段，靶向宿主代谢可能是一种可行的方法。
参考文献
1.ZhangX,TanY,LingY,etal.Viralandhostfactorsrelatedtotheclinicalout