3月以来，美格基因科学顾问、中山大学生命科学学院李文均教授课题组在高水平期刊连发3篇SCI科研论文，继研究成果分别在NationalScienceReview和NatureCommunications上发表后，近日课题组在环境生态学领域顶级期刊TheISMEJournal上发表又一力作！该文章首次描述了三个同型产乙酸的放线菌新纲，并提出了放线菌在细菌CODH/ACS进化历史中的重要地位。
焦建宇博士为文章第一作者，李文均教授和承磊研究员为文章共同通讯作者，美格基因有幸负责本研究的部分基因测序工作。以下是该文章主要研究成果的精彩解读，热烈祝贺李文均教授及其课题组！
InsightintothefunctionandevolutionofWood-LjungdahlpathwayinActinobacteria
放线菌Wood-Ljungdahl通路的功能与进化
作者：Jian-YuJiao(焦建宇),LiFu(符力),Zheng-ShuangHua(花正双),LanLiu(刘兰),NimaichandSalam,Peng-FeiLiu(刘鹏飞),Ai-PingLv(吕爱萍),GengWu(吴耿),Wen-DongXian(鲜文东),QiyunZhu(诸奇赟),En-MinZhou(周恩民),Bao-ZhuFang(房保柱),AharonOren,BrianP.Hedlund,Hong-ChenJiang(蒋宏忱),RobKnight,LeiCheng(承磊)*andWen-JunLi(李文均)*
期刊：TheISMEJournal
在线时间：.5.5
影响因子：9.18
文章简介
化能自养型微生物的碳固定在将无机物转化为有机物的过程中起到重要作用。Wood-Ljungdahlpathway(WLP)作为一种古老的碳固定通路，最近有研究其相关基因在人们通常认为化能异养的放线菌类群中发现，这无疑有可能拓展已知的自养微生物类群的多样性。然而由于功能基因调查的不完整，以及缺乏实际的生理实验证据，没有明显证据表明放线菌可以通过WLP进行碳固定；因此放线菌WLP的功能仍然未知，且具有WLP的放线菌物种多样性、进化历史以及生态功能仍然充斥着神秘色彩。
本文使用宏基因组分箱的方法，结合公共数据库，获得了42个放线菌的Metagenome-AssembledGenomes(MAGs)，属于三个放线菌新纲：Ca.Geothermincolia,Ca.Humimicrobiia和Ca.Aquicultoria。功能分析表明，这三个新纲的绝大多数MAGs都存在WLP相关的基因、氢化酶基因，以及产乙酸相关基因，因此可能属于同型产乙酸功能类群。进化分析表明，三个新纲的氢化酶具有不同的进化历史，而一氧化碳脱氢酶/乙酰辅酶A合成酶复合酶(CODH/ACS)相关基因来源于三个纲的共同祖先，并有明显的垂直传递现象。此外，研究表明放线菌可能通过多个水平基因转移事件，将CODH/ACS基因转移给Nitrospirae、Deltaproteobacteria(Desulfobacterota)和Thermodesulfobacteria的多个类群。最后，富集实验获得了氢气依赖的产乙酸富集培养物，且Ca.Geothermincolia皆有明显的生长，这与作者提出的放线菌可能具有同型产乙酸代谢推测是一致的。
本文首次提出三个放线菌新纲普遍具有WLP；通过比较基因组和富集实验，首次提出此三个新纲可能为同型产乙酸类群；此外，该研究工作通过氢化酶和CODH/ACS相关基因的进化分析，首次探究了放线菌氢依赖的WLP固碳方式的进化历史；同时，该研究也是首次对热泉生境中WLP放线菌进行富集，且对其生态功能开展的探索工作。
主要内容
1.三个放线菌新纲的鉴定
通过对热泉沉积物样品宏基因组分箱，并结合公共数据库，该研究共获得42个与WLP有关的MAGs，其中大部分（40/42）都含有WLP相关基因。系统发育分析显示，这42个基因组属于区别于已知的六个放线菌纲的三个新类群(图1）。这三个类群被GTDB指定为三个未描述的纲，本文结合系统发育分析和基因组比较分析，最终将这三个新类群鉴定为三个新纲，并分别命名为：Ca.Geothermincolia,Ca.Humimicrobiia和Ca.Aquicultoria。
图1.放线菌系统进化树2.Ca.Geothermincolia,Ca.Humimicrobiia和Ca.Aquicultoria的代谢潜能
对35个高质量MAGs（完整度≥75%，污染度≤5%）进行功能预测，在碳代谢通路中，几乎所有的基因组有完整的糖酵解、戊糖磷酸途径和氨基酸生物合成途径。基因注释结果显示，部分MAGs中具有柠檬酸合酶，但未能注释到完整的三羧酸循环，同时考虑到细胞色素氧化酶的普遍缺失，推测这三个纲的物种可能是严格厌氧微生物。尽管RuBisCO-like大亚基存在于部分MAGs中，但由于RuBisCO小亚基和磷酸核酮糖激酶的缺失，使得CBB循环的功能不太可能实现。功能聚类分析表明三个纲的整体功能差别明显，但是值得注意的是，三个新纲都具有WLP相关基因、氢化酶和产乙酸相关基因，这表明这三个类群的成员都可能是产乙酸细菌，且这种依赖于氢气的二氧化碳还原产乙酸过程，是目前放线菌类群未知的特性。
代谢通路如下图所示：
图2.Ca.Geothermincolia,Ca.Humimicrobiia和Ca.Aquicultoria的代谢通路图
文章发现，已知的放线菌6个纲中，所有的可培养放线菌都不含WLP相关的基因。但是在这3个新纲中的，WLP相关基因广泛存在。为研究CODH/ACS复合体在放线菌类群中的进化关系，作者构建了多个CODH/ACS相关蛋白的系统进化树：
图3.CODH/ACS系统进化树基于CODH/ACS复合体系统进化树与前人研究结果相类似：细菌的CODH/ACS复合体聚为“Terrabacteria”和“Gracilicutes”两支。值得注意的是，放线菌作为新成员的加入，表明其存在于“Gracilicutes”分支，且CODH/ACS在Terrabacteria类和Grracilicutes类之间存在复杂的进化史。
3.氢气依赖的Wood-Ljungdahl固碳通路
几乎所有的MAGs都预测到编码氢化酶的基因，且部分基因与WLP基因在基因组上位置十分接近，表明氢代谢对于放线菌的WLP功能的行使十分必要。在Ca.Geothermincolia、Ca.Humimicrobiia和Ca.Aquicultoria中，镍铁氢化酶(NiFehygrogenases)可能偶联氢氧化和铁氧化还原蛋白的还原。有研究表明还原型铁氧还蛋白能够提供将CO2还原为CO的电子，作者发现编码铁氧还原蛋白的基因在基因组位置上与WLP基因簇十分接近。因此，氢依赖的还原型铁氧还蛋白最可能是这类细菌的WLP的电子供体。根据基因位置信息，Ca.Geothermincolia的二氧化碳还原为甲酸可能是与氢氧化偶联的。虽然放线菌中的WLP相关酶与产同型乙酸细菌的酶有所差异，但其利用氢气与二氧化碳合成乙酸的基本过程与同型产乙酸细菌一致。具体碳固定过程如下图所示：
图4.产乙酸过程示意图由于CODH/ACS在放线菌门中普遍缺失，Ca.Geothermincolia、Ca.Humimicrobiia和Ca.Aquicultoria的WLP相关基因在基因组位置上十分保守，且系统进化树中属于独立的分支，因此作者推测WLP存在于这3个纲分化之前的放线菌祖先中。氢化酶代谢和系统发育分析表明，这三个纲使用了十分不同的氢化酶进行H2氧化，且由于放线菌的共同祖先不编码类似的氢氧化蛋白，据此推测他们的共同祖先无法通过氢依赖的WLP进行碳固定。但由于同型产乙酸相关基因的实际证据，文章提出假设，Ca.Geothermincolia、Ca.Humimicrobiia,和Ca.Aquicultoria这三个厌氧放线菌纲是有别于已知的好氧放线菌类群，能够以同型产乙酸作为主要的生活方式的三个厌氧类群。
下图为CODH/ACS与氢化酶在放线菌中的进化历史：
图5.CODH/ACS与氢化酶在放线菌中的进化历史
4.富集产乙酸型放线菌
富集培养实验发现，通过不同的培养处理(图6.a),在有H2和CO2的体系中，随着时间的流逝，H2和CO2的浓度持续下降，且在产甲烷抑制剂存在的情况下，有明显的乙酸积累，因此进一步验证了体系中存在同型产乙酸过程的存在。在特异引物PCR和16SrRNA基因扩增子测序中，发现经H2和CO2的处理的实验组存在目标放线菌类群，且目标放线菌类群相对丰度有显著提升。
在宏基因组测序数据显示，目标放线菌的可能是体系中产乙酸的重要类群，其中Ca.Geothermincolia在H2和CO2的处理的实验组相较于其它处理，相对丰度明显提高。近期研究结果表明，放线菌类群可以通过acdAB和acs基因进行产乙酸功能，同时也表明放线菌潜在的产乙酸过程。上述实验为作者提出的厌氧放线菌具有WLP并进行同型产乙酸提供了证据支撑。下图为富集产乙酸放线菌的实验设计与相对丰度：
图6.产乙酸放线菌的富集实验结果
5.G55H和G55HB处理的代谢重建
基于G55H和G55HB的个代表MAGs。文章描述了不同类群可能存在的代谢类型，提出，在富集体系中H2和CO2的添加为氢依赖的化能无机自养微生物提供了理想的环境。在这样的环境中，拥有WLP和厌氧有机质发酵的微生物得以生存，通过利用H2产生乙酸。在富集体系中，目标放线菌类群平均相对丰度和iRep值均较高，因此可能是重要的同型产乙酸功能类群。该研究的富集体系为氢依赖的化能自养微生物类群提供了理想的栖息环境，同时表明同型产乙酸微生物很可能在支持陆地热泉环境中的嗜热生态系统物质能量循环中发挥重要作用。
图7.G55H和G55HB实验组的代谢通路重建
总结
综上所述，这篇文章首次描述了三个同型产乙酸的放线菌新纲，并提出了放线菌在细菌CODH/ACS进化历史中的重要地位。这三种放线菌新纲通过独立进化的方式获得不同的氢化酶和能量保存方式，结果表明氢依赖的WLP二氧化碳固定功能发生在三个纲分化后。在55摄氏度下，对Ca.Geothermincolia的富集也证明了同型产乙酸过程在放线菌中的可能性，并表明同型产乙酸过程可能是热泉中的基础代谢过程。这项工作拓展了放线菌门的多样性和生物学功能。
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