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前言
mRNA药物的生产流程包括质粒DNA制备、mRNA原液制备和LNP-mRNA成品制备。质粒DNA的制备是mRNA药品生产的第一个工艺，包括序列设计、重组质粒构建及质粒的发酵、粗纯和精纯。
作为质粒模板制备的上游工艺，质粒构建可获得含目的基因的重组载体，便于扩增、鉴定及后续的线性化等操作，由于mRNA密码子优化、UTR和polyA尾添加等特殊需求，质粒构建的操作常被基因合成技术替代。但对于较长或保密要求性高（如特殊突变体）的基因序列，研发人员仍采用序列拼接的手段完成质粒构建。
在这篇文章中，菌菌以双酶切法和一步克隆法为例，分享重组质粒的构建流程。
空质粒和目的基因的扩增
第一步是扩增空质粒和目的基因，以获得一定量的空质粒和目的基因，用于后续的酶切连接反应。
利用大肠杆菌扩增质粒
将含有空质粒的大肠杆菌接种至LB液体培养基（含质粒对应的抗生素），过夜培养后收集菌体，按照试剂盒说明完成质粒的提取（如生工柱式质粒DNA小量抽提试剂盒）。
PCR扩增目的基因
通过聚合酶链式反应（PCR,polymerasechainreaction）扩增目的序列，PCR基本要素包括模板DNA、两端引物、dNTP（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、含Mg2+缓冲液和耐热DNA聚合酶（Taq或Pfu），PCR程序包括预变性；变性、退火、延伸，30-35循环；终延伸。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。
(1)如使用双酶切法构建质粒，需依据质粒图谱选择限制性酶切位点，且不会切割目的基因，质粒图谱的认识可戳链接查看：质粒图谱文章链接。
(2)如使用一步克隆法构建质粒，通过引物设计和PCR扩增实现同源序列为16-20bp。
图1:PCR扩增原理星耀小TIP：引物设计可使用PrimerPremier5和Oligo7等软件，设计原则包括：
①引物一般由20~30个核苷酸组成；
②引物序列包含酶切位点(双酶切法)、与目的基因互补序列；
③前后引物退火温度相差不要太大；
④引物GC含量在40~60%之间；
⑤引物应避免回文序列。
目的基因与载体的连接双酶切-连接法获得足量的空质粒和目的基因后，使用限制性内切酶（restrictionendonuclease）使二者带上相同的酶切缺口，便于连接。限制性核酸内切酶可识别并切割特异的双链DNA序列，由于II类限制性核酸内切酶识别与切割位点的序列特异性，广泛应用于DNA重组实验，II类限制性核酸内切酶通常识别6-8个碱基，具有°旋转对称的回文结构。如，EcoRI的识别序列为：5’-GAATTC-3’、3’-CTTAAG-5’，常用的内切酶有BamHI、EcoRI和HindIII。为避免质粒的自连接，通常使用两种不同的限制性内切酶进行切割，酶切产物经柱纯化或胶回收，用于后续连接实验。T4DNA连接酶（T4DNALigase）可将DNA双链上相邻的3’羟基和5’磷酸基团共价结合形成3’-5’磷酸二酯键，将具有相同缺口的DNA序列连接。将酶切后的质粒和目的基因以一定摩尔比混合，并向体系中添加T4连接酶进行连接，得到质粒-目的基因连接液。图2:双酶切-连接法构建重组质粒一步克隆法由于步骤繁琐，且基因序列可能存在多种限制性酶切位点，导致双酶切的不适用性，因此，同源重组连接法的使用愈加广泛。Gibson缓冲液包含三种酶：5’-3’核酸内切酶，暴露同源区核酸序列；DNA聚合酶，正确匹配后进行扩增；DNA连接酶，将缺口连接成环形。图3:同源重组法构建重组质粒星耀小TIP：①同源区建议选择16-20bp，过长会影响连接效率；
②片段总体积越低越好，片段摩尔比例为1:1，片段浓度一般在0.01-0.03pmol。片段数量小于3时，可将浓度提高至0.1pmol。
转化与鉴定连接液的转化（Transformation）完成DNA重组质粒的构建后，需将其导入特定的受体细胞，这一过程称为转化，重组质粒的验证常使用大肠杆菌为受体细胞，采用热激转化的方法。将空质粒-目的基因连接液与大肠杆菌感受态细胞（如E.coliDH5α）混合，冰浴放置半小时后，置于42℃热激90s，随后快速置于冰浴中1–2min,加入1ml新鲜培养基，于37℃复苏培养1小时，涂在含抗性标记的固体培养基进行筛选，得到转化子。重组质粒验证在体外连接反应中，很难实现%的连接率和转化率，实际得到的转化子包括期望重组子（含目的基因的重组质粒）与非期望重组子（不含目的基因的重组质粒），需通过双酶切和测序进行鉴定，方法简述如下：将平板上菌落转接扩培，提取质粒，使用两种限制性内切酶进行酶切、电泳，若观察到两条条带，一条与质粒长度一致，一条与目的基因长度一致，则将该质粒进行测序验证，得到构建成功的重组质粒。图4:连接液的转化与鉴定星耀小课堂下期分享：mRNA模板制备之超螺旋质粒提取流程，敬请期待~