膀胱癌是一种高发病率、高死亡率的恶性肿瘤。膀胱癌最常见的病理类型是尿路上皮癌(UC)，其中75%为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)，25%为肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。NMIBC经常复发并进展为MIBC，这通常与较低的5年生存率、癌症进展和转移有关。尽管NMIBC和MIBC表现出不同的临床结局，但与之预后相关的分子特征尚不清楚。随着我们向基于分子的客观临床分类发展，对NMBICs和MIBCs之间关系的更好的理解将是必要的。（这段框起来）
年6月3日，复旦大学人类表型组研究院丁琛团队、医院侯英勇团队、医院郭剑明团队、医院叶定伟团队和上海医院赵健元团队在JournalofHematologyOncology期刊发表了文章Integratedproteogenomiccharacterizationofurothelialcarcinomaofthebladder，利用蛋白组、基因组、转录组和磷酸化组测序分析技术等多种手段，对膀胱尿路上皮癌进行了深入研究。在这项研究中，对来自名中国UC患者的初治肿瘤和形态正常的人尿路上皮(MNU)组织进行了全面的多组学特征分析，以阐明基因组变异与表型扰动之间的关联。
研究结果
在基因组检测基础上，研究联合转录组学、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学等多重维度开展了深度分析。研究对所有患者样本(个肿瘤和配对的76个MNU)进行无标记量化测量，结果在蛋白质和多肽水平上总共有16,个蛋白质组，FDR1%。对个肿瘤样本和46个MNU样本进行了磷酸蛋白质组学分析，结果在肿瘤中有个磷蛋白和33,个磷酸位点，而在MNU中识别和量化了个磷蛋白和11,个磷酸位点。对43个肿瘤和配对的22个MNU样本进行了转录组测序，确定了每个肿瘤样本17,个基因和每个MNU样本14,个基因。
基因组特征描绘
研究收医院的45例非肌层浸润性膀胱癌(NMIBCs)和71例肌层浸润性膀胱癌(MIBCs)患者FFPE样本，并且上述病理均没有术前治疗史。研究还进行了北京队列(n=)和TCGA队列(n=)的全外显子组测序对比，本研究队列和北京队列的TMBs之间没有显著差异，TCGA队列中RB1的突变频率显著高于北京队列和我们的队列，因为TCGA患者中99%的患者是MIBC，而本队列中38%的患者是NMIBC。
研究确定了四个突变特征：SBS5、SBS1、SBS30和SBS13。肿瘤突变负荷（TMB）结果表明，代表基于DNA的切除修复的SBS30具有最高水平的TMB。此外，代表APOBEC活性的SBS13与最差的预后相关。与TCGA队列中最匹配的突变特征是SBS5和SBS13。
转录组—蛋白质组关联分析
对43个肿瘤和配对的22个MNU样本进行了转录测序；确定了每个肿瘤样本17,个基因和每个MNU样本14,个基因。计算了肿瘤的个mRNA-蛋白质对和癌旁样本的个mRNA-蛋白质对之间的相关性，研究显示癌样本中86.7%的mRN-蛋白质对展示出与细胞粘附分子缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解在内的途径呈正Spearman相关。转录组和蛋白质组学之间的不一致表明，蛋白质组学数据具有从基因组和转录组数据中无法获得的独特的致癌特征。
为了解拷贝数变异与转录组、蛋白质组磷酸化蛋白质表达的调节作用，分别进行了CNA关联分析。结果表示mRNA和蛋白质的顺式调节作用比磷酸化蛋白更显著。在所有三个组学水平之间只有个显著的顺式效应重叠。这个重叠基因在GTPase活性的正向调节、细胞周期的调节、局灶性黏附和ErbB信号通路方面显著丰富，表明核心通路受基因组异常的影响。除了重叠的顺式基因外，顺式基因对mRNA、蛋白质和磷蛋白的影响在不同的途径中都有所富集。
染色体5p(C9)和7q(SND1和ELN)上显著正向顺式效应相关的基因编码的蛋白质水平与不良预后相关，但其mRNA表达水平则不相关。与SND1相互作用的转录因子STAT3在肿瘤中高表达，往往这类患者预后较差。许多参与细胞周期的基因是STAT3的靶标，随着STAT3活性的增加而上调。数据证实了染色体7q上的两个顺式效应，SND1和CDK5。SND1表达上调调节STAT3活性，而CDK5进一步磷酸化STAT3，并促进膀胱癌细胞系WH、UMUC-3和J的细胞增殖。
基因组—转录组—蛋白质组—翻译后修饰多组学分析
为探索肿瘤发生过程中的多组学关系，在不同的组学水平上比较了肿瘤和癌旁之间的差异。RNA-seq(27,个基因)、蛋白质组数据(个蛋白质)和磷蛋白质组数据(个磷酸化蛋白质)，结果发现了个三个组学水平之间的癌和癌旁显著差异性蛋白质，这些蛋白质主要参与与内质网蛋白质加工和细胞-细胞黏附相关的途径。肿瘤中细胞周期途径的上调和跨膜转运途径的下调发生在所有组学水平，肿瘤中Uroplakin蛋白高表达的患者预后较好。
为了进一步研究主导的信号转导途径，研究了磷酸蛋白质组。结果表明，定位于个磷酸化蛋白的个磷酸肽段比相应的蛋白丰度有更大的变化(Wilcoxon，FDR0.01，T/MNU2)，包括细胞周期和细胞-细胞黏附相关蛋白(MCM2-S13，TP53BP1-S和Myh9-S等)。对肿瘤和癌旁磷酸化蛋白质组的激酶底物浓缩分析(KSEA)揭示了在肿瘤中激活的主要激酶，包括CSNK2A1、AURKA、VRK1、PRKDC、MAP2K7和ERBB2)，许多活化激酶，如PRKDC、MAP2K7和ERBB2，是已批准抑制剂的靶点。对差异化磷酸位点的进一步研究表明，在肿瘤中观察到参与细胞周期、ErbB信号传导和细胞-细胞粘附的底物升高。
NMIBC（n=45）与MIBC（n=71）患者的生存具有显著差异，研究从基因组、蛋白质组、磷酸化蛋白质组和转录组等多维度基础上对两类患者进行多组学分析。研究发现参与MIBC富集途径的蛋白质表达水平从低级别NMIBC、高级NMIBC到MIBC逐渐增加，而参与NMIBC富集途径的蛋白质表达水平逐渐降低。为了确定MIBC和NMIBC中基因组驱动因素的差异，我们比较了它们之间基因组变异的差异。在NMIBCs中更频繁地观察到FGFR3突变，而TP53和RB1在MIBCs中表现出更高的突变率。5p、7p和20q染色体扩增，在MIBCs中比在NMIBCs中更显著。其中，只有5p的增加与不良预后相关，且仅见于非MIBC患者。
MIBC患者中5p增加的比例(80%)高于NMIBC患者中5p增加的比例(20%)，这意味着5p增加在NMIBC向MIBC的进展中起作用。通路富集分析显示，与WT组相比，5p扩增组中涉及抗原加工和提呈、肌动蛋白丝基础运动和GTPase活性调控的蛋白表达上调。在mRNA和蛋白水平上分别观察到27和30个5p染色体显著正调节的顺式效应，其中9个顺式效应在两者之间重叠。9种顺式效应中，只有TrioRho鸟嘌呤核苷酸交换因子(TRIO)在MIBC的mRNA和蛋白质水平上比NMIBC显著上调，作为RhoGTP酶从GDP到GTP交换因子，促进了肿瘤的侵袭和生长。
RHOG是一种RhoGTP酶的TRIO激活酶，它的表达与TRIO在mRNA水平上呈正相关。Rho相关蛋白激酶(ROCK)是RhoGTPases的最佳表征下游效应物，在mRNA和蛋白质水平上均与RHOG呈显著相关。底物磷酸化水平进行激酶活性分析，展示TRIO激活RHOG，然后RHOG激活下游效应器ROCK1，从而增加肌动蛋白细胞骨架的重组。这种发现提示了我们5p增益在从NMIBC到MIBC进展中，与肿瘤细胞侵袭有关的肌动蛋白细胞骨架的调节机制。
肿瘤—癌旁蛋白质分子特征描绘
蛋白质组亚型和特征蛋白共识聚类基于个例样本中超过30%的种蛋白质进行了分型研究，包括了U-I(n=37)、U-II(n=23)和U-III(n=56)，亚群特异途径富集法分析表明，三个蛋白质组亚群具有不同的特征。U-I亚群具有最高水平的代谢途径，如丙酸代谢、脂代谢过程和花生四烯酸代谢(CYP2J2、ALOX5、AKR1C3等)。U-II亚群与肿瘤细胞增殖密切相关，包括细胞周期(MCM2、ANAPC4、CHEK1等)、RNA剪接、DNA修复等。U-III亚群的特征是与细胞外基质分解、补体和凝血级联以及PI3K-AKT信号通路有关的通路，其中一些通路与肿瘤环境和免疫反应有关。图5A显示了在不同组学水平上不同蛋白质组亚组之间具有代表性的途径的基因
这三型患者有别于TNM分型方式，分别代表不同临床特征。U-I患者的OS和PFS最好，U-III最差。结合临床资料，伴有乳头状癌和NMIBCs的肿瘤大多位于U-I区；而U-III期患者的神经侵犯、转移和血管侵犯程度更高。在代谢水平上，三型患者的通路富集差异明显。此外，对肿瘤转录组（n=43，共识聚类）和磷酸化蛋白质组（n=，共识聚类）聚类分析结果发现，蛋白质组与转录组保持较高的调控一致性（~59.0%），蛋白质组和磷酸蛋白质组之间为（39.5%）。总生存期较差的磷酸化蛋白质组亚组与蛋白质组学亚组U-III一致。
肿瘤—癌旁激活性主效通路分析
激酶底物富集分析发现，三种蛋白质组学亚型中观察到推断的活化激酶之间存在显着差异，其中U-I主要以TK激酶组（ERBB3、SRC、YES1等）为特征，U-II以CMGC为特征（CDK1、CDK4、WEE1等），U-III以两个主要激酶组为特征，AGC（PRKCB、PRKCE和STK10等）和CMGC（GSK3A、GSK3B、CDK5等）激酶组。
基因组信息显示亚组U-I和U-II携带更高的FGFR3突变率。值得注意的是，大多数携带FGFR3突变的肿瘤也含有PIK3CA突变，而TP53和FGFR3突变在膀胱癌中是互斥的。为了研究FGFR3的突变如何驱动其临床特征，我们检查了有或没有FGFR3突变的患者在不同组学水平上的FGFR3表达。结果表明，在mRNA、蛋白质和磷蛋白水平携带FGFR3突变的患者中，FGFR3表达较高（Wilcoxon秩和检验，p0.05；Foldchange2）。为了进一步建立遗传改变与相应下游途径之间的联系，我们探讨了FGFR3的蛋白质丰度与富集途径之间的相关性。据报道，FGFR3通过PI3K/AKT依赖性和PI3K/AKT非依赖性信号传导调节mTORC1/2-cSREBP1。这进一步提示我们，FGFR3的高表达与可能的药物依赖性激酶AKT、RICTOR和RPS6KB1的高磷酸化呈正相关，为U-I和U-II患者的治疗提供了潜在药物靶点。
免疫分析
基于蛋白质组学共识聚类分析的例肿瘤的蛋白质组学数据，利用xCell对UC肿瘤的微环境成分进行了ESTIMATE分析研究。细胞特征的一致聚类鉴定出两种NMIBC亚型和三种MIBC亚型：冷混合(n=22)；冷肿瘤(n=27)；代谢(n=11)；细胞周期(n=30)；和热肿瘤(n=26)。冷肿瘤和冷混合肿瘤来源于NMIBC。与野生型相比，携带FGFR3突变的肿瘤中角质细胞上调。热肿瘤免疫相关途径的上调，包括JAKSTAT信号传导的上调(kruskal–Wallis，p0.05)，参与肿瘤细胞识别和抑制肿瘤驱动的免疫逃逸。
有趣的是，研究发现染色体9q34.3扩增，与免疫评分显著正相关(Spearmanr=0.22，p=0.)，在热肿瘤群中比在冷肿瘤群中更频繁地观察到(Fisher，p0.05)。在蛋白质水平上观察到11种显著阳性的顺式效应，其中3种（QSOX2、TRAF2和UAP1L1）与预后不良相关。与冷肿瘤相比，在mRNA和蛋白质水平上，肿瘤坏死受体相关因子2(TRAF2)在热肿瘤中过表达，并且TRAF2的蛋白质丰度与TNFR2非经典NF-κB通路呈正相关，在这群患者体内NF-κB通路被显著激活。PD-L1（NF-κB1的靶标）的mRNA丰度与TRAF2的mRNA丰度呈正相关；TRAF2的mRNA丰度与CD8富集评分呈正相关。表明TRAF2在外周CD8+T细胞中起作用。
基于上述观察，在队列中对PD-L1免疫治疗患者样本进行了进一步研究。其中27名患者被定义为PD-L1阳性（TPS：1%），20名患者被定义为PD-L1阴性(TPS:1%)。PD-L1阳性和阴性患者之间的进一步比较分析证实了TRAF2表达升高与PD-L1表达增加之间的正相关为了进一步验证TRAF2和PD-L1之间的正相关性，我们从一个独立的验证队列中收集了FFPE样本，其中包括14名接受PD-L1抑制剂治疗的UC患者(5名有效(PR，部分有效)，9名无应答(PD，进展性疾病)我们通过连续切片的免疫组织化学方法检测了TRAF2和PD-L1在组织水平上的表达，并观察到应答者TRAF2和PD-L1的表达显著高于无应答者。这一结果进一步证实，TRAF2的高表达与PD-L1的高表达有关，并与患者的预后反应有关。
分子表型—病理表型跨尺度关联分析
为了以一种无偏倚的全蛋白质组方式探索我们队列的生物学特性，我们对个肿瘤中超过10%的个蛋白质进行加权相关网络分析(WGCNA)。共表达分析得到15个共识模块(图7A)，大小从个蛋白(MEmidnightblue模块)到个蛋白(MEturquoise模块)不等。随后，通过途径富集分析这些模块，以表征相关生物学特性。在这些模块中，meered与染色体5p增益显著相关。该模块中的基因在细胞增殖调控中富集。
为了发现不同组织变异的肿瘤在分子水平上的差异，采用基因集富集分析(GSEA)对蛋白质组数据进行分析。结果显示，氧化磷酸化、甘油磷脂代谢(PCYT2、MBOAT7、DGKA等)等代谢相关通路在乳头状癌中富集。
为了系统地识别组织学变异特异性的药物靶点，我们使用磷酸蛋白质组学数据进行了功能富集分析。乳头状癌的高表达主要集中在ERBB信号和MAPK信号。在一氧化氮合酶中上调的磷蛋白在局灶性粘连和肌肉收缩中得到丰富。ERB3/ERBB4/RAF1在乳头状癌中激活，PAK3/PAK6/CDK1在NOS中激活，PRKACA/PRKACB/PRKACG在分化变异体中激活。不同的组织学变异具有不同的通路和激活的激酶，为个体化治疗的需要提供了证据。
GARS蛋白表达验证
GARS通过非典型功能促进膀胱癌细胞增。GARS的表达水平在UC进展过程中也增加，与MNU相比，GARS在肿瘤组织中显着增加。由于尚未报道GARS与膀胱癌的发病有关，我们探讨了GARS在膀胱癌进展中的作用。使用蛋白质印迹，研究证实GARS蛋白水平在肿瘤组织中显著上调。
用LC-MS测定代谢产物谱显示，在GARS过度表达的细胞中，戊糖磷酸途径被激活，而糖酵解被下调(图2)。8C)。这些结果表明，上调的GARS通过激活戊糖磷酸途径通量促进DNA合成和促进细胞增殖。免疫共沉淀实验验证了GARS与PGK1之间的相互作用，以及GARS与PKM2之间的相互作用，并与和T24细胞系中外源表达的蛋白质进行了联合免疫沉淀分析。结果发现GARS的上调表达水平通过抑制PGK1和PKM2的活性而促进了戊糖磷酸途径，从而促进了UC的进展。
结论
研究首次描绘了中国人群膀胱癌的蛋白质组学特征。研究发现5p染色体扩增是参与从NMIBC到MIBC进展的关键因素。基于蛋白质组学的UC分类结合多组学数据揭示了每个亚组和亚组特异性激酶的分子特征。免疫亚型分析显示，9q34.3扩增与更高的PD-L1表达相关。最后，我们发现GARS通过抑制PGK1和PKM2的活性来增强戊糖磷酸途径通量，从而促进人膀胱癌细胞系T24和的膀胱癌进展。这些结果表明GARS可能成为UC的新治疗靶点。
参考文献
[1]XuN,YaoZ,ShangG,YeD,WangH,ZhangH,QuY,XuF,WangY,QinZ,ZhuJ,ZhangF,FengJ,TianS,LiuY,ZhaoJ,HouJ,GuoJ,HouY,DingC.Integratedproteogenomiccharacterizationofurothelialcarcinomaofthebladder.JHematolOncol.Jun3;15(1):76.doi:10./s---7.PMID:;PMCID:PMC.
END
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