PTEN通过抑制PI3KAKTmTOR [复制链接]

肾细胞癌（renalcellcarcinoma,RCC)占成人恶性疾病的2%3%,是男性常见肿瘤的第7位,女性常见肿瘤的第10位1]，且RCC的发病率会随人口年龄的增长而进一步上升[2]。目前，世界卫生组织将RCC分为透明细胞癌、乳头状细胞癌以及嫌色细胞癌。其中,75%~90%为透明状细胞癌，10%~15%为乳头状细胞癌，4%~5%为嫌色细胞癌[3]。定位于染色体10q23上的PTEN基因可以抑制多部位癌细胞的增殖[4]。PTEN可以介导蛋白的磷酸化作用，3,4,5-三磷酸脂酸肌醇(phosphatidylinositol-3kinase,PIP3)是PTEN的最常见的底物。PIP3是细胞内信号通路的第二信使，D3位点上被PTEN磷酸化后可以直接抑制PI3K的活性，参与PI3K/AKT信号通路的负性调节[5]。PIP3/PI3K-AKT信号通路主要调节细胞的新陈代谢、细胞增殖和细胞迁移，并且在肿瘤的发生发展过程中有着至关重要的作用。肿瘤的发生，通常会引起PTEN的功能紊乱、变异或者沉默，造成PI3K/AKT信号通路的活化。先前的研究中发现，肿瘤产生的药物耐受性，也很可能是因为PTEN的功能紊乱而导致的[],PTEN的功能紊乱同时也会显著提高肿瘤入侵和迁移能力。本实验就卡博替尼对肾透明细胞癌的治疗作用进行了探索，为卡博替尼的临床应用提供了一定的实验依。

1材料与方法

1.1试剂RPMI-()、胎牛血清（FBS)()、高糖DMEM培养基（H-DMEM)()、GultaMax()购自Gibco公司；盘尼西林-链霉素混合试剂（P)、MTT试剂盒(M)购自索莱宝生物科技公司；EcRI(RL)、Xhol(RL)购自NEB公司；HieffTranS脂质体核酸转染试剂（ES01)、G购自翊圣生物公司；Cabozantinib(S)、SF(S)购自Selleck公司；动物组织/细胞RNA提取试剂盒（CW)、HiFi-ScriptcDNA第一链合成试剂盒（CW)、SuperTaqMan—步法荧光定量PCR试剂盒(CW)购自康为世纪公司;SUCLG2(ab)、AC02(ab)、p53(ab26)、Bel-2(ab)、BAX(ab)、增殖细胞核抗原（PCNA)(ab29)、AKT(ab)、p-AKT(ab)、mTOR(ab)、p-mTOR(ab)抗体购自Acm公司;-0细胞（TCHu)购自中科院上海典藏细胞库。

1.2载体构建通过聚合酶链反应获得PTEN的CDNA，所用引物序列为：上游引物5’-CGGAATTCGGATGTCCCGAAAGCAGG-3’；下游弓丨物:5’-CCGCTCGAGTCAGATGTTGAGCGG-3’。PCR产物和pCDA3.1-3xFlag载体用EcRI和Xh〇I进行双酶切，酶切后的引物片段及载体进行过夜连接以构建pCDA3.1-3xFlag-PTEN过表达质粒。按照HieffTrans脂质体核酸转染试剂说明书，将pCDA3.1-3xFlag-PTEN过表达质粒载体及空白质粒转入-0细胞，通过%g/mL的G筛选稳定表达的-0细胞。

1.3细胞培养和分组于37h,5%C02环境下使用含10%胎牛血清的RPMI-培养基培养-0。将-0分为6组:对照组(NC),卡博替尼处理组（NC+C),PTEN抑制剂组(PI),卡博替尼处理合并PTEN抑制剂组（PI+C)，PTEN过表达组（PO)以及卡博替尼合并PTEN过表达组（PO+C)组。分别用5%M，10和20卡博替尼处理NC+C、PI+C和PO+C细胞24h，筛选合适浓度的卡博替尼在后续实验中对细胞进行处理，实验前使用无菌PBS清洗，移除残留的卡博替尼。

1.4MTT实验检测各组细胞存活率参照之前的研究进行MTT实验[7]。细胞接种于96孔板上，每孔接种密度控制在1x左右。当细胞融合度达到80%~85%时，在培养基中加入不同浓度的卡博替尼。加药24h后，使用无菌的PBS清洗细胞去除多余的卡博替尼。加入MTT使其终浓度为5mg/mL，继续孵育4h。孵育结束后，终止培养，加入DMSO,选择nm波长，在全波长酶标仪上测定各孔光吸收值，每组各做3个复孔计算细胞生存率。细胞生存率=(1-加药组OD值/对照组OD值）x%。

1.5RNA提取和反转录按照动物组织/细胞RNA提取试剂盒说明书进行RNA提取实验。细胞裂解后在室温下静置孵育5min，随后在rpm离心5min。向溶液中加入乙醇，并将混合物转移至吸附柱，rpm离心1min，使RNA与吸附柱结合。清洗缓冲液清洗吸附柱后，用无RNA酶水洗脱RNA。洗脱后得到的溶液用ND-分光光度计测量RNA的浓度。取相同量的RNA进行反转录实验。按照反转录试剂盒说明书配制反应混合物，混合物于42°C反应15min，随后与85°C反应5min，即得到CDNA。

1.6实时荧光定量PCR(qPCR)检测p53、BAX和Bcl-2基因的表达量qPCR反应条件如下:预变性95°C，30-变性95°C，5-退火55°C，30s以及延伸72C，30-进行40个循环。循环阈值(CT)根据扩增后的荧光信号进行计算设置。2-AACt方法计算基因的相对表达量[8]。GAPDH作为内参，并以GAPDH为标准，对目的基因表达进行定量。每组实验均独立重复3次，扩增引物序列见表1。

1.7Westernblot检测PI3IKAKT/mTOR信号通路、凋亡相关蛋白和三羧酸循环关键酶的表达量蛋白提取前，用预冷的PBS清洗每组的细胞样品，随后使用RIPA裂解缓冲液裂解细胞。裂解后样品于rpm离心10min，收集上清，并通过BCA实验确定蛋白样品浓度。每组取相同量的蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，用半干法将蛋白样品转移至0.22%m的硝酸纤维素膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1h，SUCLG2、ACO2、p53、Bcl-2、BAX、PCNA、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR—抗（1稀释）于4°C孵育过夜。孵育结束后，与室温下羊抗兔二抗（1孵育1h。ECL发光法检测目的蛋白的表达，ScionIma/e软件对条带的灰度值进行分析。GAPDH作为内参对目的蛋白进行均一化处理。

1.8统计分析使用GraphPad(version7)进行数据分析。计量资料以均数±标准差(7±"表示。为避免实验的偶然性，每一组实验被独立重复3次。利用单因素方差分析对每一组独立平行实验进行比较分析。$0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1卡博替尼对-O细胞增殖的影响MTT实验结果显示，卡博替尼抑制-O细胞的增殖，并呈现剂量相关的影响（见图1)。加药5卡博替尼24h后，细胞生存率为（90.3±4.86)%，在10m//mL卡博替尼实验组，细胞生存率为(73.60±3.12)%，在20卡博替尼实验组中，生存率降为(52.4±2.1)%。通过实验数据，可得在加药浓度为10和20实验组中，卡博替尼显著地抑制了-0的生（$0.05)。因此，我们拟定使用10%M尼进行续实验，在此浓度下尼在抑制-0细胞生多依然活。2.2AKT/mT0R信号通路中分子表达水平各组中p-AKT/AKT和p-mT0R/mT0R的比值如图2。NC+C组及PI+C组与其对应的对照组，其p-AKT/AKT比值并著差异。P0+C组与对照组及P0组其p-AKT/AKT比值显著（$0.05)。p-mT0R/mT0R在各组中的比值呈现出于p-AKT/AKT类似的变化趋势。尼处理后，各组p-mT0R/mT0R表达量均出现下降。与PI组，PI?C组中p-mT0R/mT0R比值显著降低（$0.05)。而P0?C组中p-mT0R/mT0R的比值对比NC组显著降低（$0.05)。

2.3凋亡相关分子表达的变化如图3所示，对比NC组，在NC+C组中p53的表达量略有下降，但计学差异。PI组中p53的表达与NC组相著（$0.05)，PI+C组中p53的表达与PI组著增加而与NC组著（$0.05)。P0组及P0+C组中p53表达与NC组相改变。此外，尼理会增加BAX的表达量，PI+C组及P0+C组中，与对应的对照组相比出现显著增加（$0.05)。与NC组相比，PI及PI+C组中BAX的表达量显著（$0.05)，而PI+C组中BAX表达量则显著增加（$0.05)。此外，NC+C组以及P0+C组中BCL-2的表达量与其对应对照组著（$0.05)，P0组中BCL-2表达量与NC组出现显著（$0.05,见图4)。

3讨论

RCC是最常见的系统肿瘤之一，已逐渐上大癌症病因[)]。在癌的3种型中，将95%透癌，其5年生为74%。的研究发现，的龄、肿瘤TNM分级与RCC的预后密切[10]。此研了PTEN表达抑制及PTEN过表达的，并且：实验发现，尼通过抑制PI3IKAKT/mT0R信路和糖代谢来抑制-0的，从而引起-0的凋亡最终起到抗肿瘤效应。同时发现，PTEN可能会尼对于透明细癌的作用，呈现协同效应。PTEN是一种肿瘤抑制基因，通过控制细胞磷脂的活性来调节的从而达到抑制肾癌、癌和癌生长的作用[11]。

PTEN的活性大部分在其碳端，其磷酸化能够改变PTEN的亚细胞定位，而PTEN活性的变异以及脂活性丧失与癌症的发生密切的关系[12_14]。因此，本实验针对细胞内PTEN改造，以观察PTEN对药物治疗作用的影响。PI3IKPTEN/AKT信号通路与细胞的生长密切，信号通路的功能紊乱或者异常都会引起的异常生长，引起肿瘤的发生[15]。大量癌症细胞中均发现PIK3/AKT路的活化，路与癌症的持续生长和不良预。PI3IKAKT的下游分子mT0R的活性与癌症的发展也密切。此前的研究发现，抑制mTOR的表达抑制中的自噬作用，大大提物的抗肿瘤效应[16]。此研究中，卡博替尼作用细胞后，PI3IKAKT/mT0R信号通路的活性受的抑制，这一趋势在PTEN过表达中更加显著，抑制PTEN表达将会削弱作用。实验结果表明，尼抑制：PI3IKAKT/mTOR信号通路的活性，抑制肿瘤细胞的增殖，从而发挥抗肿瘤作用。PTEN过表达则会进一步增强卡博替尼对肿瘤细胞的抑制作用，发挥协同作用。

B1-2家族和P53都是细胞凋亡的重要调节因子，在细胞凋亡的调节过程中有着重要的作用。BAX和B1-2都是B1-2家族的成员，BAX，B1-2和P53也是PIK3/AKT/mTOR信号通路下游分子，在细胞凋亡过程中起到重要的作用。在正常组织中，p53执行多种功能，包括细胞周期调节，细胞稳态维持以及细胞凋亡。但J53的变异会诱导癌症发生，超过50%癌症患者体内的转录因子p53发生了变异。进一步的研究发现，p53的表达在人体癌变组织中经常被抑制[17]。因此，p53被认为是一种抑癌基因。PTEN可以与p53直接相互作用，通过Mdm2抑制p53的降解，进而增强p53的表达[18]。此外，p53可以直接激活PUMA的表达活性，PUMA在Bel-2同源物3(BH3)域上与B1-2或Bel-XL结合，诱导BAX的表达[1)]。此次研究结果显示，卡博替尼处理细胞后会在基因和蛋白水平增加细胞内p53的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖，当PTEN过表达后，会进一步放大这种效应，而PTEN表达抑制后则会减弱这一效应。BAX属于B1-2家族，也是一种肿瘤抑制蛋白，在细胞自身凋亡过程中起着重要的作用[20]。BAX定位于线粒体外膜上，在外界促凋亡刺激因子及p53作用下被激活和移位，是诱导细胞凋亡起始的重要环节[21]。BAX可以促进线粒体中细胞色素C的释放，并且活化多种细胞凋亡蛋白酶，诱发肿瘤细胞中的亡。此研结果表，尼从蛋白和转录水平增加BAX的表达，且过表达PTEN将会增强这一趋势，抑制PTEN将会减弱这一趋势，从而促进肿瘤细胞的凋亡。B1-2是B1-2家族中抗细胞凋亡蛋白，在人体肿瘤组织中发现B1-2家族中例如B1-2和Bel-XL等抗凋亡基因的表达上调[22]。B1-2的过表达不仅与肿瘤细胞发生和延续密切相关，同时也与肿瘤细胞对化疗药物的耐药型有着密切的关系[23]。卡博替尼处理后会在蛋白和转录水平降低B1-2的表达量，PTEN的过表达则会加强这一效应，进而减弱细胞内的抗凋亡进程，促进肿瘤细胞的凋亡。上述结果表明，卡博替尼可以活化细胞凋亡过程并且抑制抗细胞凋亡相关蛋白的表达，引起肿瘤细胞的凋亡而发挥抗肿瘤作用。PTEN过表达会增强这一作用，而PTEN表达敲低则会减弱这一作用。

快速增殖是肿瘤细胞的基本特征，为了维持肿瘤细胞新陈代谢的需要，新陈代谢过程将会发生变化，加大葡萄糖的摄取和优先利用是其重要的特征之一[24-25]。三羧酸循环是细胞内糖类化合物转换成能量的关键步骤，参与许多生理学进程。近期研究发现，癌细胞中的TCA循环是与正常细胞不同，谷氨酰胺等非糖类化合物均可用来供给能量，以满足其代谢的需求[26]。由此我们推测，卡博替尼的抗肿瘤作用可能与TCA循环相关分子表达量的改变有关，从而影响肿瘤细胞内的有氧氧化过程。ACO2和SUCLG2是TCA循环中的关键酶。ACO2通过中间产物顺乌头酸可逆催化柠檬酸生成异柠檬酸，SUCLG2是琥珀酰辅酶A合成酶的亚基，可以可逆催化琥珀酰辅酶A和琥珀酸酯的形成。卡博替尼对于这两种酶的作用呈现相反的趋势，作用细胞后，出现ACO2的表达的上调和SUCLG2的表达的下调。在PTEN过表达后，上述作用得到进一步增强，而PTEN表达抑制后上述作用则被削弱。上述结果表明，卡博替尼的抗肿瘤作用可能与其抑制肿瘤细胞TCA循环关键酶，进而减少肿瘤细胞的能量供应，诱导细胞的凋亡，发挥抗肿瘤作用，PTEN表达的增加则会增强卡博替尼的抗肿瘤作用。此次研究中发现，卡博替尼通过抑制肿瘤细胞内IP3K/AKT/mTOR信号通路的活性以及肿瘤细胞内TCA循环关键酶的活性，抑制细胞的有氧氧化过程，减少细胞功能，进而在诱导促凋亡蛋白表达的同时抑制抗凋亡蛋白的表达，最终诱导肿瘤细胞的凋亡，发挥抗肿瘤作用。而PTEN过表达后，卡博替尼的抗肿瘤作用得到了增强，在PTEN表达降低后，卡博替尼的抗肿瘤作用出现了减弱，表明PTEN的表达与卡博替尼的抗肿瘤作用可能存在协同效应，有可能成为未来治疗eRCC的新策略。