治疗白癜风多少钱 http://news.39.net/bjzkhbzy/170206/5214886.html疫情以来，mRNA疫苗迅速破圈走红，刮起了一场“催生新一代疗法的医学革命”。实际上，早在年代，科研人员就首次发现了mRNA。此后历经半个多世纪的探索，直至年新冠mRNA疫苗上市，这款被寄予厚望的明星产品终于走向商业化落地的初舞台。
mRNA技术大放异彩的背后，是工艺技术的大跨步进展。研究表明，核酸的PolyA结构可以让mRNA在细胞中免受核酶的降解，增强mRNA的稳定性，同时PolyA结构长度可以控制转录效率。因此，有效地检测核酸尾部PolyA的长度及不同长度A的占比是评估mRNA质量的重要指标。
随着越来越多mRNA产品的研发申报，客户对于polyA分析方法的可靠性和完成周期提出了更高的要求，这也对研究型实验室提出了更高的挑战。本期#微谱药研院·技术共探，我们将共同探讨LC-MS法检测mRNA核酸PolyA尾长的原理，以两则案例展开分析，并就常见问题给予答疑。如果还有更多疑问，欢迎文末留言讨论！
1、方法原理
mRNA样本的PolyA酶切处理一般采用RnaseT1酶。T1酶的特异性酶切位点是G碱基右侧的磷酸二酯键，而酶切后的PolyA尾片段回收方式一般有两种：一是直接将PolyA尾片段从mRNA中进行直接分离后上机分析；二是在前一步基础上，再利用Oligo磁珠提取PolyA尾巴片段进行上机分析（LC-MS）。
2、案例分析
CASE01T1酶直接酶切，无纯化
T1酶直接酶切，前处理简单，但是杂质较多。对于碱基个数多的核酸片段，出峰时间会靠后，见图1。对单个峰进行原始质荷比图的提取，通过原始质荷比图的特征定位PolyA尾巴片段。
PolyA尾巴片段的原始质荷比图为正态分布或者类正态分布，见图2。
再对质谱数据进行解卷积分析可得到结果，见图3。
CASE02T1酶切和Oligo磁珠纯化
与前面的方法相比，加入olig磁珠虽然使得前处理变复杂，成本也会相对升高，但最终呈现的效果会有明显提升，杂峰也显著减少，见图4。
对于一个mRNA样品,假设理论序列如图5所示。采用T1酶酶切，可能会有2段PolyA尾巴片段。但是多段尾巴可能在TIC图上是重叠的，原始质荷比图也会有所重叠，但分子量不会重叠，如图4所示，RT为8.81min的峰，其实是两段PolyA尾巴片段（碱基差异值是35A）的重叠。
1)当碱基个数相差更多时，可在TIC图上看到区别，同样原始质荷比图可以看到有所叠加，如图6所示。根据碱基个数多的核酸片段，出峰时间会靠后的特点，合理选择提取原始质荷比图的范围或者优化液相参数，可对被T1酶切成两段的PolyA尾巴片段进行数据分析。
2)也可优化液相参数将两段加尾片段在UV和TIC图谱上进行分离，如图7所示。两段加尾片段的原始质荷比图和解卷积图谱见图8和图9。
PolyA尾巴片段主要报告不同长度尾巴片段的占比，根据不同长度A在解卷积图谱上的响应值来计算。一般理论分子量和实际分子量的差值不超出2Da。
计算公式如下所示：
比例（%）=（X/S）×%
X：不同PolyA长度的峰高，不同的PolyA长度利用其分子量来区分。
S：所有检测到的不同PolyA长度的峰高之和。
3、常见答疑
Q：理论分子量和实测分子量对不上？
A：注意碱基是否有修饰，一般U碱基会进行甲基化修饰。
T1酶的特异性酶切位点是G碱基右侧的磷酸二酯键，尾部片段中G碱基在尾巴片段的左边和右边，理论分子量差值是80。
Q：如何获得完整的加尾片段？
A：可利用H酶的特异性，切割DNA和RNA的杂交位点，但是会有多个切割位点。
先根据RNA的理论序列设计探针，在加尾片段的前段形成DNA和RNA杂交链；然后利用H酶的特异性获得完整的加尾片段。
Q：解卷积图谱中加合峰的来源?
A：化合物在质谱中出峰，大部分情况下是以加H+的模式，但是也有因为系统（流动相中、系统管路、六通阀、喷雾针等均可能）中或者前处理过程中有残留的金属离子，而形成金属离子加合峰的情况。
采用磁珠纯化过程中会使用到一些金属离子钠，锂，流动相中可能还会出现钾，这都可能会导致加合峰的产生。
同时，同一个仪器测试多个不同类型的项目，这种使用方式也可能会带来加合峰的产生。
Q：检测不到尾巴片段？
A：流动相在超声过程中，瓶子敞口，导致六氟异丙醇挥发。
操作环境的温度可能导致核酸降解。
